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Address for correspondence : Sung-Ho Kang, MD, Department of Otorhinolaryngology, Konkuk University School of Medicine, 322 Danwol-dong, Chungju 380-701, Korea
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서 론
중이와 이관의 점막상피는 섬모세포와 혼합성 분비세포로 이루어져 있으며 이들에 의해 만들어지는 점액층과 섬모 주위액은 항상 일정하게 유지되며, 이 용액들이 일정한 점도를 유지하기 위해서는 수분의 양이 정확하게 조절되어야 한다. 최근에 호흡상피의 water channel protein(aquaporin: AQP)들이 발견되었는데 이것은 동식물과 세균에서 세포막을 통한 수분의 이동을 촉진시키는 특별한 channel을 구성하는 세포막의 단백질 중 하나이다. 각각의 아쿠아포린은 조직 특이적으로 분포하며, 세포에서의 분포도 다르게 나타나며, 삼투압 농도에 반응하여 특이적인 수분 이동을 담당한다. 이렇듯 정상 이관과 중이 내에서 아쿠아포린의 region specific한 특징을 근거로 하여, 중이 및 이관 내 염증 유발 시 발현할 수 있는 아쿠아포린 아형의 차이를 알 수 있다면 중이염, 특히 급성중이염의 병태 생리를 밝히는데 도움이 될 것이라고 생각하였고, 이에 본 연구에서는 중이 및 이관에서 lipopolysaccharide(LPS)로 인한 염증상태에 따른 아쿠아포린의 발현양상을 시간대별로 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
Tissue preparation
체중이 200 내지 300 g 정도되는 Wistar-Kyoto계의 흰쥐를 ketamine과 xylozine을 복강 내로 주사하여 마취시킨 후 콩팥, 악하선 허파 말단 부위는 제거되었으며, 이관의 상피조직은 중이관 입구에서부터 인후부 입구까지 채취 하였으며 주로 인두 부위의 이관을 주로 사용하였다. 또한 중이 점막은 양귀 모두에서 채취하였다. LPS를 주입하기 전 상태의 3마리 흰쥐에서 채취한 조직을 비교 대조군으로 하였고, 이후 각 3마리씩 중이 내에 50
μL LPS(10 μg/ mL)1)를 주입한 흰쥐를 1 hr, 4 hr, 8 hr, 16 hr, 24 hr, 48 hr, 72 hr 후에 이관과 중이 조직을 채취하여 동일한 방법으로 reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)을 시행하였다.
RT-PCR
세포내의 RNA는 TRIzol(Life Techlologies, Carlsbad, California, USA)을 이용한 acid guanidine thyocyanate-phenol-chloriform 추출방법으로 분리하고 SuperScript II(Life technologies, USA)를 사용하여 complementary DNA(cDNA)를 역전사 하였다. PCR은 MJ PTC-200 Pelter cycler 내에서 각각 95℃에서 15분간, 94℃에서 30초간 35회, 60℃에서 30초간, 그리고 72℃에서 1분간 시행하였다. 사용한 primer의 sequence는 AQP 4(NM 012825) forward GAATCCAGCTCGATCCTTTG, reverse CT CCATGTAGCTCCCTTTCG, AQP 5(NM 012779) forward CTCTGGGACC TGTGAGTGGT, reverse CGCC CGTTGTGTTGTTGTTC이었으며 House keeping gene으로는 rat 18S-rRNA을 사용하였으며 forward GTGGA GCGATTTGTCTGGTT, reverse CGCTGAGCCAGTC AGTGTAG 이었다. 처리 후 산물은 1.5% agarose gel을 이용해 분리하였고 ethidium bromide를 이용하여 염색한 후 촬영하였다.
Quantiative image analysis
Quantitative real time PCR을 위해 SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, Atlanta, GA, USA)를 이용하여 정량화하였다. 조직 간의 유전자 양을 비교하기 위하여 18S-rRNA를 사용하였다.
통계학적 분석
통계학적 분석은 SPSS 15.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 1-way analysis of variance(ANOVA) test로 검증하였으며,
p<0.05를 기준으로 통계학적 유의성을 평가하였다. 사후 분석을 통하여 같은 시간대 3마리 쥐들에서 발현한 mRNA 차이는 평균값에서 통계학적 차이가 없는 것을 확인하였고, 시간에 따른 변화는 통계학적으로 유의한 것을 확인하였다(p<0.001).
결 과
이관과 중이 조직에서의 AQP mRNA의 발현
RT-PCR을 이용하여 이관조직 및 중이 점막에서의 AQP 4와 5 둘다 mRNA의 발현을 확인하였다(Fig. 1).
Quantitative real time PCR을 이용한 이관과 중이에서의 비교 분석
AQP 4의 경우, 정상군에서는 이관에서 중이 점막보다 약간 더 많이 존재하였지만 LPS 투입 후 중이 점막에서는 1 hr 후부터 의미 있게 증가하기 시작하여 8 hr 지나면서 최고치를 보였으며 72 hr까지 지속되었다. 반면 이관에서는 1 hr 후부터 의미 있게 서서히 증가하기 시작하여 24 hr에서 최고치를 보였다가 감소하였다(p<0.001).
AQP 5의 경우, 이관과 중이 점막에서 거의 비슷하게 분포하였지만, LPS 투입 후 중이 점막에서의 증가는 AQP 4에 비하여 증가의 폭은 적었으며 투입 1 hr 후부터 의미 있게 증가하여, 16 hr에 최고치를 보였으며, 이관에서도 1 hr에서 증가하기 시작하여 8 hr과 16 hr에 최고치를 보인 후 지속되었다(p<0.001)(Fig. 2).
고 찰
중이염은 세균이나 바이러스 등이 중이에 침입하여 염증을 일으키는 질환으로 주로 이관을 통하여 감염을 일으키는 것으로 알려졌으며, 초기 단계에는 이관이 염증으로 인하여 붓고, 서서히 막히면서 중이안의 압력상태 변화로 이충만감을 일으키는 것이 현재 중이염의 알려진 병태 생리이다.
중이의 점막은 주로 단순 편평상피와 일부 배상세포(goblet cell)로 구성되어 있으며, 이관의 중이 개구부 주위에는 80%가 섬모상피로 이루어져 있고. 이 섬모상피는 중이강내 저류액의 배출에 중요하며 중이강내에 염증이 발생할 때 이 섬모운동의 기능저하로 이차적인 세균감염을 일으키기 쉽게 한다. 반면 이관의 점막은 주로 호흡상피세포인 위중층 섭모 주세포(pseudo-stratified ciliated columnar epithelium), 배상세포, 비섬모세포(non ciliated cell)로 구성되어 있다. 이관의 섬모상피는 이관의 인두부로 갈수록 밀도가 높아지는 것으로 알려져 있다.
이관의 인두 입구부위에 분비기능과 관계하는 분비세포가 많이 존재하며 이 중 배상세포는 섬모 상피에 끼어 있으며, 저부에 많이 나타나고 이관 전체를 통하여 섬모세포가 있는 곳에 더 많이 존재하고 일반적으로 염증 시에 증가 된다. 또한 이관과 중이 내 점막에 분포하는 호흡 점막은 적절한 양의 수분 균형을 유지하는 것이 중요하다. 그 이유는 섬모체 주변의 수분 유지를 통하여 점액 섬모의 기능이 잘 유지할 수 있기 때문이다.2,3,4)
현재 이관에서의 상피세포의 수분유지는 상피세포 기저막내의
Na+, K+-ATPase(아데노신 삼인산화 효소)에 의해 생성된 에너지를 통하여 발생한 나트륨 의존 삼투압 차이에 의하여 수동적으로 조절되고 있다고 추정하고 있다.5) 또 다른 수분 유지에 관한 연구가 아쿠아포린에 관한 것이다.
아쿠아포린은 포유류 내의 13개 상동의 물을 수송하는 단백질로서, 상피, 내피, 결체조직에 분포한다. 사람과 쥐에서 아쿠아포린의 결핍으로 인한 이상들을 통하여 우리는 생리적으로 아쿠아포린의 중요한 점을 알 수 있다. 이 연구를 통하여 아쿠아포린이 삼투압 차이에 의한 빠른 수분 움직임뿐만 아니라, 빠른 등장성의 상피 내 수분 흡수 역시 가능하게 할 것이라고 추정하고 있다. 이 효과는 폐 속과 기도 표면의 습기 유지, 신생아의 허파 꽈리관 내의 수분 재흡수, 폐부종의 형성과 해소에 있어서 중요하다. 비록 이관과 중이 내에서의 아쿠아포린에 의한 물 이동의 생리학적 역할이 완전히 밝혀진 것은 아니지만, 이런 분자들이 호흡기 점막에서 물의 흡수와 분비를 가능하게 해주고 있는 것으로 알려져 있다.6)
그 중 아쿠아포린 4는 뇌속의 아교세포(glial cell)에서 많이 발견되며, 뇌의 부종 조절에 관여한다. 또한 청력과 시력 손상을 막아주는 역할을 하며, 골격근육 세포에서도 발견되며, 위 내의 벽세포(Gastric parietal cells), 집합관 원형세포의 basolateral membrane에서 발견된다. 또한 이관의 상피세포에서도 관찰된다.
아쿠아포린 5는 주로 외분비선에서 많이 발견되는데, 허파꽈리 상피세포 특히 type 1 상피세포의 apical membrane에서 아쿠아포린 5가 발현된다. 십이지장의 Brunner샘에서도 발견되며, 흰쥐에서 estrogen 투여 시 자궁에서 발견되었다. 침샘과 점막하 분비관의 수분 분비의 감소를 막아주는 역할을 하기도 하고 최근 상기도의 점막하 분비관에서도 수분 분비의 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌으며,7) 이관과 중이 점막에서도 발견되었다.
본 연구에서는 백서의 중이와 이관의 관련하여 ciliated 상피세포의 basolateral membrane에서의 아쿠아포린 4의 발현을 관찰하였고, 점액성 분비세포가 아닌 수분이 풍부한 장액을 분비하는 장액성 분비세포의 apical membrane에 있는 아쿠아포린 5를 발견할 수 있었다. Minami 등8)도 중이내의 아쿠아포린 발현 연구에서 아쿠아포린 4는 ciliated 상피세포의 basolateral membrane에서 위치하는 반면 아쿠아포린 5는 flat, columnar 상피세포뿐 아니라 cilated 상피세포에도 위치하는 것을 발견하였다.
이런 점으로 미루어 볼 때, 아쿠아포린 5가 장액성 분비 세포내에서 수분이 풍부한 장액성 용액의 이동과 분비에 관련되어 있을 것을 생각해 볼 수 있을 것이다. 이와 유사하게 Funaki 등9)은 눈물샘 내부 acinar cell(샘꽈리세포)의 apical membrane과 장액성 침샘의 세포내 분비소관으로 뻗어 있는 microvilli 위의 아쿠아포린 5가 특이적으로 발견되는 것을 발견하였다.
이에 본 연구에서는 이관과 중이 내에 염증을 유발하여, 급성으로 발생하는 중이염의 환경을 정상 상태에서부터 염증이 유발된 상태의 시간의 경과를 두고 관찰하고자, 그람 음성균의 박테리아 내독소로서 세균의 세포막에 존재하는 분자이며 선천성 면역반응을 일으키어 염증 반응을 유발하는 LPS를 중이강 및 이관 내에 50
μL(10 μg/mL) 주입 후 시간의 경과에 따라 아쿠아포린 4, 5 발현 양상을 관찰하였다.
LPS 투여 전의 중이점막과 이관내의 ciliated 상피세포에 존재하는 아쿠아포린 4는 Quantiative real time PCR 결과 이관에서 좀 더 많이 관찰되었으나 LPS 투입 이후에는 중이 점막에서 이관보다 더 많이 증가하였는데 이는 정상 중이강 내의 점막에는 림프조직이 없고, 상주하는 백혈구도 매우 적지만 항원에 대한 면역반응이 활발하고 말초혈액으로부터 림프구의 유입도 잘 일어나므로10) 이관보다 더 예민하게 반응하는 것으로 생각이 된다. 반면 아쿠아포린 5는 LPS 투입 전에는 이관과 중이 점막에서 비슷하게 분포하였으나 LPS 투입 후에는 이관에서의 증가가 더 빠르고 뚜렷한 것으로 관찰되었는데 이를 통하여 이관내의 장액 분비세포가 중이강 보다 더 많이 분포되는 것으로 생각된다.
결 론
LPS 처치 후, 아쿠아포린 4에서는 이관보다 중이강에서의 증가율이 더 빠르고, 더 높은 것은 이관보다는 중이 점막이 보다 더 예민하게 반응하는 것으로 생각된다. 아쿠아포린 5는 중이강보다는 이관에서 증가율이 더 높게 나왔는데 이는 중이강에서의 장액분비세포가 이관보다는 훨씬 적게 분포하고 있기 때문인 것으로 생각된다. 본 연구를 통해 이관과 중이 점막에서 아쿠아포린 4, 5는 염증 반응에 대하여 발현이 증가함을 알 수 있었다. 이관 및 중이 점막에서 아쿠아포린 아형들의 다양한 특징적인 분포형태와 염증 반응에 따라 증가하는 것은 정상 생리 유지를 위한 특별한 작용을 하는 부분이 있음을 보여주는 것이고 더 나아가 중이염에서의 병태생리에도 역할을 할 것으로 생각하여 볼 수 있다고 제시해 볼 수 있겠다.
본 실험은 중이 내와 이관의 염증을 유발한 후 아쿠아포린 4, 5의 발현을 정량화하여 증가함을 밝혔고, 이것이 한 개체의 항상성(homeostasis) 유지를 위한 염증 치유 과정과 연관이 있을 것이라는 가정 하에 진행된 것으로, 보다 정확한 인과 관계를 알기 위해서는 염증 치유과정 중 아쿠아포린 4, 5의 역할을 증명할 수 있는 실험이 필요할 것으로 사료된다.
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