Developmental Change of P2Y4 Receptor in Outer Sulcus Cells of the Rat

Lee, Jun Ho; Heo, Jeong-Hwa; Han, Doo-Hee; Kim, Chang-Hee; Chang, Sun O; Kim, Chong-Sun; Oh, Seung-Ha

Original Article

Genetics

Korean Journal of Audiology 2005;9(1):35-42.

Developmental Change of P2Y4 Receptor in Outer Sulcus Cells of the Rat

Jun Ho Lee¹, Jeong-Hwa Heo², Doo-Hee Han¹, Chang-Hee Kim², Sun O Chang², Chong-Sun Kim², Seung-Ha Oh²

¹Departments of Otolaryngology-Head Neck Surgery, Seoul National University College of Medicine, Seoul National University Bundang Hospital, Seongnam
²Departments of Otolaryngology-Head Neck Surgery, Seoul National University Hospital, Seoul, K

신생쥐 와우 Outer Sulcus Cell에서의 P2Y4 수용체 발현 변화

이준호^¹^, 허정화^²^, 한두희^¹^, 김창희^²^, 장선오^²^, 김종선^²^, 오승하^²

^¹서울대학교 의과대학 분당서울대학교병원 이비인후과학교실
^²서울대학교 의과대학 서울대학교병원 이비인후과학교실

Abstract

Cochlear outer sulcus cells (OSC) are located between the organ of Corti and K⁺ secretory cells and known to sustain transepithelial cation currents. It has been thought that P2X₂ receptors in OSC provide parasensory K⁺ efflux pathway in response to intense noise exposure. However, little is known during development. The purpose of this study is to investigate purinergic receptors in developing rat OSC using voltage-sensitive vibrating probe technique. Results showed that there was no response to 100 μM ADP, UDP, and adenosine at any postnatal age. The response to UTP was greatest at postnatal day 1 (P1) and rapidly decreased to near adult level until P7 when the endolymphatic ion composition is known to be accomplished. This UTP-responsive P2Y receptor was found to be P2Y₄, evidenced by the inhibition of UTP effect in the presence of 100 μM reactive blue 2, an antagonist at rat P2Y₄. These temporal changes of purinergic receptors in developing OSC would be associated with cellular differentiation and/or establishment of the endolymphatic ion composition for normal auditory transduction.

Keywords: Voltage-sensitive vibrating probe;P2Y receptor;Cochlea;Outer sulcus cell.

교신저자：이준호, 467-707 경기도 성남시 구미동 300
교신저자：전화) (031) 787-7404, 전송) (031) 787-4705 E-mail：junlee@snu.ac.kr

서 론

와우 내림프는 K⁺이 높고, Na⁺, Ca²⁺이 낮은 세포외액으로 채워져 있다. 이는 소리전달의 필수조건이라 할 수 있다. 내림프의 항상성은 몇 가지 호르몬¹⁾²⁾³⁾과 퓨린 수용체⁴⁾⁵⁾에 의해 조절된다고 알려져 있다. 내림프에서 양이온의 흡수 및 분비를 조절하는 세포 중 하나로 outer sulcus cell(OSC)이 알려져 있으며, 대개 코르티기와 K⁺ 분비세포 사이에서 와우외벽의 아랫부분에 위치하며, 자세히 보면 나선융기(spiral prominence)와 기저막 사이에 존재한다.⁶⁾ OSC는 다양한 강도의 소리 자극에 대해 와우 내림프내의 적절한 K⁺농도를 유지한다고 받아들여지고 있다.⁷⁾ P2X₂는 면역화학염색⁴⁾ 및 기능적 방법⁸⁾에 의해 OSC에서 발현됨이 알려져 있다. OSC에서 P2X₂의 기능적 역할은 커다란 소음에 대해 유모세포를 보호하고자 와우 여러 부위에서 내림프 내 K⁺이 유출되며, 그 중의 한 곳이 OSC로 생각된다.⁸⁾⁹⁾
이상 언급된 견해는 성체에서 얻은 것이 대부분이며, 발생과정의 OSC에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. OSC에서 P2X₂ mRNA 발현은 생후 0일에서 in situ hybridization¹⁰⁾을 통해 알 수 있었으며, P2X₂ 단백질이 생후 9일째부터 면역화학염색을 통해 발견되었다.⁴⁾ 퓨린수용체 발현의 변화가 발달과정의 두뇌 및 내이에서 보고된 바 있다.¹¹⁾¹²⁾¹³⁾¹⁴⁾ 이번 연구의 목적은 발달 과정의 OSC에서 voltage-sensitive vibrating probe technique을 통해 다른 퓨린수용체의 발현을 알아 보고자 한다.

대상 및 방법

조직의 준비

생후 1일부터 21일 사이의 Sparague-Dawley 쥐가 사용되었다(P1, P3, P5, P7, P14, and P21). 마취에는 pentobarbital(50~100 mg/kg；i.p.)이 사용되었고, 서울대학 동물실험위원회의 프로토콜에 따라 승인되었다. 해부 방법은 와우 첨부 측벽에서 나선인대를 분리한다. 혈관조는 변연세포의 영향을 배제하기 위해 나선인대로부터 제거한다. 그 후 OSC가 밖을 향할 수 있게 둥글게 나선인대를 접는다.⁸⁾ 각 조직은 도립현미경위에 관류액 챔버에 옮겨지고, 37℃, 0.3 times/sec의 속도로 관류된다.

Voltage-sensitive vibrating probe(VP)

와우 첨부에서, OSC는 2~4열 만이 내림프에 노출되어 있다.⁶⁾ VP 팁의 직경은 약 20 μm이며, 나노 범위의 전압을 측정할 수 있다. 전류 흐름 내에서 두 지점에서의 진동은 생리용액이 가지고 있는 저항을 통한 전류에 상응하는 전압을 얻게 된다.¹⁵⁾ 진동막대기법은 이전의 방법과 동일하다.¹⁵⁾¹⁶⁾ 간단히 말해서, I_sc는 진동 platinum-iridium wire microelectrode에 의해 측정되고, electrode는 parlene-C(Micro Electrodes, Gaithersburg, MD, USA)로 절연되어 있으며, 노출된 tip은 platinum black으로 코팅되어 있다. 진동은 수평(X), 수직(Z) 축으로 약 20 μm 범위이다. X-axis는 상피세포 표면에 수직이다. 컴퓨터 제어 하에 stepper-motor manipulators(Applicable Electronics, Forestdale, MA)와 특별한 probe software(ASET version 2.0, Science Wares, East Falmouth, MA)를 통해 상피 표면 30 μm에 위치한다. Bath references는 26-gauge platinum-black electrode이다. 보정은 glass microelectrode(tip<1 μm OD)을 이용하여, 전류 소스로 3 M KCl을 채운 생리액(see below)에서 이루어졌다. 진동주파수는 200~400 Hz 범위이며, 2가지 직각방향에 대해 잘 분리되었다. 신호는 dual channel phase-sensitive detector로 확인하였다. probe의 비대칭성은 두 진동방향에 대해 다른 공명주파수를 얻을 수 있었다. X, Z detector 신호는 16 bit analog to digital converter(CIO-DAS1602/16, ComputerBoards, Mansfield, MA, USA)로 연결되었다. 샘플링 간격은 0.6 s였고, 이 소프트웨어의 최소치였다. 전극은 I_sc가 최대 X값, 최소 Z값을 얻을 수 있는 곳에 위치시켰다；데이터는 전류밀도의 벡터 길이로 나타냈고, Origin software, version 6.1(OriginLab Software, Northampton, MA, USA)를 통해 얻었다. 데이터는 상피의 specific short circuit current 뿐만 아니라, probe 위치와 각 조직 샘플의 정확한 기하학적 위치에 영향을 받는다. 논문에서 보고된 전류밀도는 probe위치에서 흐름을 의미하며, 경 상피 부분만을 나타낸다. 이번 실험에서 부종이나 위축에 의한 probe 위치 변화는 관찰되지 않았다.

Solutions and chemicals

모든 실험에서, 양측 상피는 150 NaCl, 3.6 KCl, 1 MgCl₂, 0.7 CaCl₂, 5 glucose, 10 HEPES, pH 7.4의 perilymph-like physiologic saline(mM)으로 관류되었다. Adenosine 5'-triphosphate(ATP, Sigma A-9187, St. Louis), Uridine 5'-triphosphate(UTP, Sigma U-4630), 2'- & 3'-O-(4-benzoyl-benzoyl)adenosine 5'-triphosphate(BzATP, Sigma B-6396), α,β-methyleneadenosine 5'-triphosphate(αβmeATP, Sigma M-6517), β, γ-methyleneadenosine 5'-triphosphate(βγmeATP, Sigma M-7510), Uridine 5'-diphosphate glucose(UDP-G, Sigma U-4625), reactive blue 2(RB-2, Sigma R-115), pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2', 4'-disulfonic acid(PPADS, Sigma P-178), gadolinium chloride(Gd³⁺, Sigma G-7532)는 사용하기 직전에 바로 생리액에 첨가되었다. Uridine 5'-diphosphate(UDP, Sigma U-4125)와 adenosine 5'-diphosphate(ADP, Sigma A-2754)의 경우는 상업적인 제품의 경우 소량의 UTP, ATP와 함께 제공되기 때문에 hexokinase(1 unit/ml, Sigma H-4502) 및 glucose(5 mM)와 1.5시간 동안 미리 처리하였다.¹⁸⁾ Amiloride(Sigma A-7410)는 DMSO에 녹여졌고, 그 다음 0.1% DMSO로 control solution에 희석되었다. 이 농도의 DMSO는 short circuit current에 영향을 미치지 않았다.

Data presentation and statistics

분석을 위해 peak I_sc를 사용하였다. 데이터는 I_sc mean±S.E.M.(n=number of tissues)으로 표현하였다. I_sc 증가 감소는 p<0.05에서 통계적 의의가 있는 것으로 판단하였다. 통계학적 분석은 대응표본 T 검정(paired t-test)을 통해 이루어졌다.

결 과

The I_sc across developing OSC

I_sc는 나이에 따라 증가하였다. 각각 -2.0±0.4(P1), -3.3±2.0(P3), -3.6±0.9(P5), -4.8±0.8(P7), -8.8±0.6(P14), -10.3±0.4 μA/cm²(P21)의 결과를 얻었다(n=5 each).

Effects of purinergic agonists with age

실험 초기에 발달 과정의 OSC에서 가능한 류린 수용체를 찾기 위해 다양한 퓨린성 작용제를 시험해 보았다. 그 중에 ADP(agonist at P2Y₁), UDP(P2Y₆), adenosine(P1 receptor)은 100 μM 농도에서 생후 어떤 시기에서도 Is를 변화시키지 못 하였다(Fig. 1, n=5 each). Rat P2X₁ and P2X₃의 strong agonist, P2X₂에 대한 weak agonist 인 100 μM αβmeATP 관류¹⁹⁾도 모든 시기에서 약한 반응을 얻게 되었다(Fig. 1, Table 1). 100 μM βγmeATP(agonist at P2X1)도 P1, P3에서 I_sc를 변화시키지 못하였다(n=2, each). ATP 및 BzATP는 상대적으로 early age(P1, P3, P5)에서 큰 변화를 보였으나, BzATP 효과는 ATP와 비교해 볼 때 나이(P14, P21)에 따라 감소하였다(Fig. 1, Table 1). P2X₂의 경우 αβmeATP, BzATP, ATP에 대해 agonist potency가 잘 알려져 있다.¹⁹⁾ 비록 EC₅₀을 각각 얻지는 못했지만, 성체 gerbil OSC에서 보고된 것과 마찬가지로,⁸⁾ Agonist의 P2X₂-like potency order(ATP>BzATP>>αβmeATP)가 P21에서 보여진다(Fig. 1F). UTP에 대한 반응은 초기에는 크다가, P21에는 점점 사라지게 된다(Fig. 1).
생후 초기에 UTP-responsive P2Y receptor 아형을 발견하기 위해, rat P2Y₄ receptor에 대한 antagonist 인 RB-220)가 도입되었다(Fig. 2A). P3 시기의 OSC dissection이 상대적으로 용이하므로, P3 OSC를 택하였다. 5분간 100 μM RB-2를 적용하였을 때 I_sc의 의미 있는 변화는 발견되지 않았다. 100 μM RB-2 적용상태에서, 100 μM UTP로 stimulation 하였을 때 I_sc는 RB-2가 없을 때와 비교하였을 때 95.3±2.7%(n=5) 만큼 억제된다(Fig. 2A, Table 2). 반면에, rat P2X₁, P2X₂, P2X₃, P2X₅, P2X₇, P2Y₁의 antagonist 인 100 μM PPADS¹⁹⁾²¹⁾ 적용상태에서, 100 μM UTP로 자극하였을 때는 의미 있게 영향을 미치지 못하였다(5.8±3.0% inhibition, n=5, Fig. 2B, Table 2). Gd³⁺는 성체에서 첨부의 P2X₂ ligand-gated nonselective cation channel을 포함해서 nonselective cation channel들을 억제한다고 알려져 있다.⁸⁾ 100 μM Gd³⁺ 존재 하에서, 100 μM UTP로 자극하였을 때는 Gd³⁺ 없이 자극하였을 때와 비교하여, I_sc가 97.6±1.1%(n=5) 억제되었다(Fig. 2C, Table 2). Amiloride는 낮은 농도에서 epithelial Na⁺ channel을, 높은 농도에서는 Na⁺-H⁺ exchanger를 억제하는 것으로 알려져 있으며,²²⁾ fetal distal lung epithelium에서 한 유형의nonselective cation channels을 억제하는 것으로 보고되고 있다.²³⁾ 100 μM amiloride의 존재 하에서, 100 μM UTP에 의한 자극은 I_sc를 거의 억제하지 못하였다(14.7±5.8% inhibition, n=5, Fig. 2D, Table 2). 이런 결과를 종합해 볼 때, UTP가 P3 OSC에서 P2Y₄ activation에 의해 apical nonselective cation channel을 통해 양이온 흡수를 촉진한다고 여겨진다.

고 찰

Developmental change of I_sc in OSC

표준용액에서의 마이너스 I_sc는 성체 OSC에서 ATP-insensitive nonselective cation channel을 통한 양이온 흡수로부터 기인한다고 여겨져 왔다.²⁴⁾ 금번 연구에서 I_sc는 나이에 따라 증가하였는데(-2.0부터 -10.3 μA/cm²까지), 이는 nonselective cation channel의 발달을 의미할 수 있지만, 이 연구 결과만으로는 단정을 지울 수는 없다 하겠다. 이번 연구에서 P21에 측정된 I_sc(-10.3 μA/cm²)는 이전에 adult gerbil에서 얻은 결과(-9.8 μA/cm2)와 매우 유사하였다.⁸⁾ 발달 초기 OSC에서, 이온 채널 밀도, 그리고, 기저막의 Na⁺ 및 K⁺ 등을 배출하는 구조, 예를 들면 Na⁺, K⁺-ATPase나 K⁺ channel 등 각각의 성숙도에 영향을 받는다. 이점에 대해서는 추후 patch-clamp technique을 이용한 single channel study 등이 필요할 것이다.

Functional characterization of P2Y₄ in the neonatal OSC

P2Y 퓨린 수용체는 G-protein을 매개로 신호전달이 이루어진다. P2Y₁, P2Y₂, P2Y₄, P2Y₆, P2Y₁₁ 등 5가지 포유류 P2Y 수용체가 cloning 되었으며, P2Y receptor family로 받아들여지고 있다.²¹⁾ 최근에는 P2Y₁₂, P2Y₁₃, and P2Y₁₄ 등이 추가되었다.²⁵⁾²⁶⁾ 이번 연구에서, P2Y₄ 수용체가 발달과정에 있는 OSC에서 발견되었다. 이전의 연구에서, 성체 OSC에서는 P2Y₄ 수용체가 발견되지 않았다.⁸⁾ 다른 P2Y receptor들은 ADP(rat P2Y₁, P2Y₁₂, P2Y₁₃), UDP(P2Y₆), UDP-glucose(P2Y₁₄)에 반응을 보이지 않는 것을 바탕으로 발달과정 및 성체 외구세포 모두에서 거의 발현되지 않는다고 볼 수 있다.²⁵⁾ P2Y₄를 제외하고 남은 아형은 P2Y₂이나, RB-2는 P3 외구세포에서 UTP 반응을 감소시키기 때문에 P2Y₂가 관련될 가능성은 적다 할 수 있다(Fig. 2A). RB-2는 Xenopus oocyte에서 rat P2Y₂ antagonist가 아니라 P2Y₄의 antagonist이다.²⁰⁾ 발달과정에 있어서 OSC에서 P2Y₄ 신호전달은 I_sc 증가 소견을 만드는데 이는 amiloride에 의해서가 아니라, Gd³⁺에 의해서 blocking 된다(Fig. 2C and D). 위의 사실들을 토대로 우리의 결과는 초기 발달 단계의 OSC에서 양이온 흡수가 nonselective cation channel을 통해 P2Y₄에 의해 activation 됨을 시사한다고 볼 수 있다. Protein kinase C나 intracellular Ca²⁺가 P2Y₄ agonist에 대한 반응으로 nonselective cation channel을 흥분시키는데 중요한 역할을 한다고 가정할 수 있다. Aplysia bag cell neuron에서 protein kinase C가 nonselective cation channel 활동성을 증가시킨다는 보고가 있고,²⁷⁾ nonselective cation channel이 Ca2+에 의해 activation 된다는 연구결과가 있다.²⁴⁾ P1에서 P2Y₄의 기능발현은 분명하고, P7이 될 때까지 급격히 떨어진다. P7과 P14 사이에는 UTP 반응은 매우 약하다.

Physiological significance

현재 연구에서, 발달상에 있는 OSC에서 P2Y₄ 감소는 거의 성인 내림프 이온조성을 갖추는 P7에 완성된다. 이런 퓨린 수용체의 일시적 변화의 생리적 중요성에 대한 가능한 가설이 있다. 첫째, neonatal OSC에서 P2X4의 존재는 내림프 이온 조성의 성숙 및 유지에 기여할 것이다. 발달 과정 동안, 성체와 같은 내림프 조성은 와우의 구조적인 성숙과 나란히 거의 P7에 일어난다.²⁹⁾ 반면에 청각은 생후 2주경에 시작된다.³⁰⁾ P1에서, 내림프 조성을 살펴보면 K⁺ 및 Na⁺ 농도가 각각 104.2와 36.4 mM 이다. K⁺ 농도는 P5와 P7 사이에서 극적으로 증가한다. 생후 7일 mouth cochlea에서 K⁺ 농도는 201.1 mM이 된다. Na⁺ 농도는 급격히 줄어들어 P5에서 4.1 mM이 되며, P7에서 성체 수치인 2.6 mM로 된다.³¹⁾ 이 개념은 OSC에서 첨단 막을 통한 각종 이온들의 전기화학적인 유인력, 내림프의 ATP 수치, 아직까지 알려지지는 않았지만 어떤 자극 요인들과 관련이 있을 것이다. 성체에서, guinea pig cochlea 내림프에서, ATP 수치는 소음폭로 시에 7.4에서 16.0 nM로 의미 있게 증가한다.⁹⁾ 반면에 내림프로부터 Na⁺ 만을 선택적으로 배출하는 능동적인 과정이 존재하는 것으로 여겨진다. 이런 목적으로 주목 받고 있는 세포는 Claudius 세포와 Reissner막의 상피세포이다. 강한 amiloride-sensitive epithelial Na⁺ channels(ENaC)의 발현이 생후 12일에 세포에서 in situ hybridization을 통해 발견되었고, ENaC mRNA가 P2부터 P12까지 증가하였다.³²⁾ 성체 Reissner’s 막 상피세포에서 ENaC functional activity가 관찰되었다.³³⁾ 이런 가능성들은 추후에 논의되어야 할 것이다.
둘째로, 출생 초기 및 아마도 배아기에 P2Y₄는 cellular proliferation을 담당할 것으로 여겨진다. 이점에 대해서는 대동맥 평활 근세포,³⁴⁾ rat 사구체 혈관주위세포,³⁵⁾ 인간 장관상피 암종세포³⁶⁾ 등에서 보고가 있다. 과도한 소리자극이 있을 때 미성숙한 유모세포를 보호하는 역할이 생후 초기에 P2X₂를 대신해서 parasensory pathway를 통해 가능할 것이다.

결 론

P2Y₄는 내림프 구성이 완전하게 발달하기 전까지 일시적으로 발현되며, 일시적인 퓨린 수용체의 변화는 정상청각기능 및 특이적 세포 분화의 필수조건인 독특한 내림프 구성과 관련될 것이다.

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