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Anatomy and physiology
Korean Journal of Audiology 1997;1(2):169-175.
Expression of p53 & Ki67 & Apoptag in Human Cholesteatoma
Yang-Sun Cho1, Young-Hyeh Ko2, Jae Yun Jung1, Sung Hwa Hong1, Won Ho Chung1
1Department of ORL-HNS
2Diagnostic Pathology, College of Medicine, Sung Kyun Kwan University, Samsung Medical Center, Seoul, Korea
중이 진주종에서의 p53, Ki67, Apoptag의 발현양상
조양선1, 고영혜2, 정재윤1, 홍성화1, 정원호1
1성균관대학교 의과대학 삼성서울병원 이비인후과학교실
2진단병리학교실
Abstract

The unique pathologic feature of cholesteatoma is known to be the accumulation of keratin debris within the middle ear cavity resulting from migration, hyperproliferation and differentiation of basal keratinocytes in the epidermis of the external ear canal skin or tympanic membrane in response to inflammation in this cavity. As accumulation of p53 is known to be associated with the number of Ki67-positive cells,2) it can be assumed that p53 expression increases as a response to enhanced proliferation. We tried to detect the degree of proliferation and the degree of apoptosis in cholesteatoma using Ki67, in association with p53. The matrials presented here are composed of 16 cases of middle ear cholesteatoma and 4 cases of normal skin. We used immunohistochemical staining for detecting p53 and Ki67 and used the Apoptag® kit to quantify apoptosis. There were significant difference between cholesteatoma and normal skin in the number of p53 and Ki67 positively stained cells. Apoptosis was more prominent in cholesteatoma than in normal skin. These results suggest that accumulation of keratin debri in cholesteatoma results from hyperproliferation of keratinocyte and subsequent apoptosis, which is thought to be induced by p53. 

Keywords: Cholesteatoma;Ki67;p53;Apoptosis.
서론 p53은 tumor suppressor gene으로 잘 알려져 있는 분자량 53 kDa의 nuclear phosphoprotein으로, mutant type p53이 악성종양과 관련하여 최근까지 많은 연구가 행하여지고 있는 상태이다. Wild type p53의 정상적인 역할은 genome을 보호하는 역할을 하여 DNA가 손상된 경우에 세포의 증식을 G1 stage에서 멈추게 하여 DNA를 복구하게 하고, 복구가 안될 경우에 손상 받은 세포의 고사를 일으키게 된다.1)2) Ki67는 분자량 345 kDa과 395 kDa의 두 개의 단백질로 이루어져 있으며 G1 stage와 mitosis사이의 증식이 활발히 일어나는 세포에서 발견된다. Ki67은 증식이 활발한 정상 피부조직과 다양한 피부병변에서 양성으로 나타나는데 피부병변의 경우에서는 p53도 양성을 보여 이러한 피부병변에서의 각화세포의 증식에 대한 반응으로 wild type p53이 축적되어서 증식된 각화세포의 고사에 관여한다고 생각되고 있다.2) 중이강에 생기는 진주종의 형성은 중이강의 염증으로 인한 외이도나 고막외층의 각화세포의 중이로의 이동, 과증식, 분화로 인한 각질축적의 결과로 이해되고 있다. 분화의 최종 단계인 각질화는 곧 일종의 programmed cell death로서 고사의 결과로 볼 수 있으며 p53이 이 과정에서 관여하는 것으로 알려져 있다.3) 고사는 일반적인 괴사로 인한 세포의 죽음과는 달리 미리 준비된 사망 프로그램을 가동시킴으로써 이루어지는 능동적인 형태의 죽음을 말하는데 p53 이외에도 많은 유전자들이 고사에 관여하는 것으로 알려져 있다.4) 저자들은 Ki67을 이용하여 진주종 검체에서 증식의 정도를 객관적으로 측정하고, 아울러 고사에 중요한 작용을 하는 것으로 알려진 p53발현 정도를 이들 진주종에서 규명하려 하였다. 그리고 고사를 객관적으로 나타낼 수 있는 terminal transferase mediated dUDP biotin nick end labeling(TUNEL) 염색을 병행하여 고사의 증가를 증명하고자 하였다. 재료 및 방법 연구 대상 중이 진주종으로 유양동삭개술 및 고막성형술을 받은 환자에서 진주종 조직을 얻었으며, 이때 외이도피부를 소량 채취하여 비교하였다. 진주종은 16례에서 관찰하였으며, 외이도 피부는 4례에서 관찰하였다. 조직의 처리 수술시 채취된 조직에 대하여 채취된 조직은 10% buffered formalin으로 10∼16시간 동안 고정을 한 후에 paraffin block으로 만들어서 진주종과 정상 외이도 피부에서의 p53, Ki67, Apoptag의 분포를 조직면역화학적 염색으로 확인하였다. 면역조직화학적 염색방법 Ki67 면역 조직 화학적 검사를 위하여 파라핀에 포매한 조직을 4 μm두께로 슬라이드(Probe On Plus, Fisher Sci, U.S.A.)에 부착하고 xylene에서 탈파라핀한 후, 95%에서 70% 알코올까지 점차로 낮은 농도의 알코올에 함수하고 증류수로 세척하였다. 이어서 메탄올로 희석한 0.03% 과산화수소에 20분간 처리하여 내인성 과산화효소를 제거하고 phosphate buffered saline(PBS, 0.01 M, pH 7.4)으로 세 차례 세척하였다. 그 후 실온의 수조에서 차단혈장과 30분간 반응시켜 비특이적 결합을 차단하고 1:100으로 희석한 일차항체인 Anti-Ki67(monoclonal mouse anti-Ki67 nuclear antigen, Zymed laboratories, U.S.A.)을 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어 PBS로 세차례 세척하고, 이차항체인 biotinylated anti-mouse IgG(Vector Elite kit, Vector laboratories, U.S.A.)를 실온에서 30분간 반응시켰다. PBS로 세차례 세척한 뒤 ABC reagent(Vector laboratories, U.S.A.)를 가하고 실온에서 45분간 반응시켰다. 다시 PBS로 두차례 세척하고 tris buffer(0.05 M, pH 7.6)에서 평형을 맞춘 후 0.05M tris buffer로 희석한 diaminobenzidine tetrahydrochloride(Sigma Chemicals, U.S.A.) 용액(pH 7.6)에 0.03% 과산화수소를 혼합하여 조직과 반응시켰다. 3분 내지 6분 후 증류수로 세척하고 Harris 헤마톡실린으로 20초간 대조 염색한 후 Permount로 봉입했다. p53 Ki67에서와 동일한 방법을 이용하였으며 일차항체로 1:100으로 희석한 monoclonal anti-mouse p53항체(Zymed laboratories, U.S.A.)를 이용하였다. In situ labeling of nuclear DNA fragmentation using Apoptag (Oncor, In situ apoptosis detection kit, Gaithersburg, U.S.A.) 10% 중성 포르말린에 고정하고 파라핀에 포매한 조직을 4 μm두께로 슬라이드에 부착하고 xylene에 탈파라핀한 후, 95%에서 70% 알코올까지 점차로 낮은 농도 알코올에 함수하고 완충액으로 5분간 세척하였다. 다음으로 proteinase K(20 μg/ml)와 상온에서 15분간 반응시켜 조직절편에서 단백질을 녹여낸 후 증류수로 씻어내었다. -20℃에 보관되어 있는 TdT(terminal deoxynucleotidyl tansferase)를 완충액으로 희석한 2∼3% 과산화수소에 5분간 처리하여 내인성 과산화효소를 제거하고 완충액으로 다시 두 차례 세척하였다. 75 μl의 완충액을 조직절편에 점적한 후 상온에서 10∼15 분간 부치(incubation)시킨 후 54 μl의 working strength TdT enzyme을 조직절편에 점적하였다. 이 후 37℃에서 1시간동안 부치시킨 후 완충액으로 상온에서 10분간 반응시켰다. 이어 조직절편을 PBS로 세 차례에 걸쳐 5분간 세척하고 55 μl의 anti-digoxigenin- peroxidase로 상온에서 30분간 반응시켰다. 다시 조직절편을 완충액으로 네 차례에 걸쳐 상온에서 5분간 세척하고 DAB (Diaminobenzidene) substrate로 상온에서 3분 내지 6분간 처리했다. 증류수를 이용하여 세차례 1분간 씩 세척한 후 Harris 헤마톡실린으로 20초간 대조 염색한 후 Permount로 봉입하였다. 결과의 판독 및 통계적 처리 p53과 Ki67의 발현의 정도는 500개의 상피세포들 중에서 양성으로 염색된 세포수의 백분율로 표시하였으며, apoptosis를 관찰할 때에는 Apoptag에 양성으로 염색된 세포와 염색이 되지 않았지만 핵의 위축과 염색체의 응축(pyknosis)이나 분절화(karyorrhexis)의 전형적인 고사의 형태를 보인 세포들도 포함하여 백분율로 표시하였다. p53, Ki67, apoptosis의 발현정도의 차이가 진주종과 정상피부 사이에서 의미있게 존재하는지를 보기 위해 비모수 검증법인 Wilcoxon test를 사용하였다. 결과 Ki67 중이 진주종에서의 Ki67의 발현은 조직에 따라 그 정도의 차이가 있었으나 대부분 기저층과 일부 유극층에서 뚜렷이 관찰되었다. 세포 내에서의 분포는 대부분이 핵내부에 염색이 되어있는 양상이었으며 세포질염색은 경미하였다(Fig. 1-A). 외이도세포에서도 Ki67의 염색에 양성을 보인 세포들을 관찰할 수 있었는데 주로 기저층에 존재하고 있었으며 세포핵 내에 갈색으로 염색되었다(Fig. 1-B). 두 군간의 비교에서 진주종과 외이도피부 사이에 발현정도의 의미 있는 차이를 발견할 수 있었다(Table 1). p53 p53은 진주종에서 주로 기저층과 일부의 유극층에서 염색되었으며(Fig. 1-C), 정상조직에서는 거의 염색이 되지 않아(Fig. 1-D) 의미있는 발현의 차이를 보였다(Table 1). Apoptag Apoptag 염색에 양성을 보인 세포와 형태학적으로 고사의 특징이 관찰된 세포를 세어서 비교한 결과 고사의 정도는 진주종에서 외이도피부에 비해 의미있게 높은 발현률을 보였다(Table 1). 두 군에서 양성으로 관찰된 세포들은 거의 대부분 과립층에 존재하였다(Fig. 1-E and F). 고찰 중이에 발생하는 진주종은 상피세포의 과증식, 분화 그리고 고사(programmed cell death)의 결과로 생기는 각화상피의 축적과 함께 이소골과 주변 측두골의 파괴를 일으키는 만성 중이염의 형태이다. 중이에 생긴 염증에 대한 반응으로 면역학적으로 활성화된 세포로부터 유리된 cytokine과 growth factor들이 외이도 혹은 고막외층으로부터 각화세포의 이동, 과증식, 분화, 각화를 일으키게 되고 이로 인하여 keratin의 축적이 이루어져 진주종의 형성이 이루어진다.3) 진주종의 이러한 특징적인 과증식성을 객관적으로 증명하기 위한 연구들 중에 Bujia 등은 중이 진주종의 조직과 정상 피부 조직에서의 proliferating cell nuclear antigen (PCNA)의 발현을 비교하였다. 이 연구에서 정상 피부조직에서도 PCNA 양성반응을 보인 세포들을 기저층에서 관찰할 수 있었으나 진주종에서는 기저층과 기저상층(suprabasal cell layer)에서 유의하게 발현이 많이 되었다고 하였다.5) 과증식성을 증명하기 위한 다른 지표로서 Ki67은 S-phase에 있는 세포만을 발견할 수 있는 PCNA의 경우와는 달리, G1, S, M phase에 있는 cell proliferation- associated protein을 모두 발견하기 때문에 보다 완벽하게 조직의 증식 정도를 나타내게 된다.6) 저자들은 Ki67을 이용한 본 연구의 결과 진주종에서 정상피부에 비해 높은 양성률을 보여 병적인 과증식성을 확인할 수 있었으며, Bujia 등은 다른 연구에서 PCNA대신 Ki67을 이용하여 정상 피부조직과 진주종의 조직을 비교하여 PCNA와 동일한 결과를 얻을 수 있었다.6) p53은 잘 알려진 tumor suppressor gene의 products로서 세포증식을 억제하며2), G1 cell cycle check point를 활성화하여 손상된 DNA를 복구하거나 DNA 손상에 의한 고사를 유도하는 것으로 알려져 있다.7) p53은 세포 내에 그 양이 제한되어 있으며 반감기가 짧아서 wild type은 일반적인 면역조직화학적 염색에 의해 발견될 수 없는 것으로 알려져 있다.1) 그러므로 wild type의 p53이 검출되기 위해서는 유전자의 돌연변이가 있거나 p53 연관 단백질과의 결합에 의하여 반감기가 증가하여야 하는데, 이러한 단백질에는 SV40 large T Ag, E6 (HPV),8) MDM2 12)등이 알려져 있으며 진주종에서 발견되는 heat shock protein (HSP)과의 안정화된 결합 때문이라는 설도 제시되고 있다.9) 또 다른 요인으로 p53의 반감기에 대해서는 일반적으로 rodent study에서 5∼20분 정도로 알려져 있는데 배양된 인간의 상피세포에서 측정한 반감기는 3∼5.5시간으로서,10) 조직 내에서 충분한 양이 생성이 된다면 발현될 수도 있을 것으로 생각된다. 돌연변이가 없는 양성 조직에서의 p53의 발현은 후두유두종, 후두결절, 후두용 등의 양성후두질환,11) 피부모반,1) 편평태반(lichen planus),12) 다형성 홍반(erythema multoforme) 등13)에서 연구가 되었으며 이들은 모두 wild와 mutant 모두에 반응하는 pan-antibody를 사용하였으나 이러한 양성조직에서 나타나는 것은 wild type일 것이라고 추정하였다. 진주종조직에서의 p53의 발현은 염색체 연구에서 알려진 바와 같이 악성종양과 같은 유전자의 불안정에 따른 과발현은 아닐 것이며 p53이 과증식을 멈추고 고사를 유도하기 위한 기전으로서 나타난 것이다.14) Albino 등은 진주종 검체의 95%에서 p53에 염색이 되었고 상피세포 중에서의 p53의 양성세포의 비율은 평균 7.5∼16.5%라고 했으며,14) Shinoda등의 연구에서는 monoclonal anti-human wild type p53 항체를 이용하여 진주종상피의 과립층에 있는 각화세포의 핵 속에서 p53의 존재를 확인할 수 있었다.15) 이번 연구에서 발현이 된다고 알려진 wild type p53항체를 이용하여 연구를 시도하였으나 염색이 전혀 되지 않았고 pan-antibody를 사용하였을 때는 만족스런 결과를 얻을 수 있었다. 이러한 현상에 대한 원인으로 추정할 수 있는 것은 wild type 항체의 경우 mutant type이 염색이 되지 않도록 많은 epitope를 차단하였고 따라서 민감도가 pan-antibody에 비하여 떨어지기 때문이라고 생각되었다. 따라서 본 연구에서도 발현된 p53이 wild type라는 것을 추정만 할 뿐 증명을 할 수는 없었는데 이러한 점에 대해서는 향후 gene sequencing이나 western blotting 등을 통한 증명을 해야 할 것이다. 대부분의 각화세포에 대한 연구에서는 p53이 기저층에 주로 염색되었는데 한 연구에서는 과립층에 진하게 염색이 된다고 하였다.15) 이러한 현상에 대한 설명으로 각화세포 분화의 모든 과정에서 p53이 관여하는 것 같으며 분화의 각 단계에 걸쳐 각각 다른 conformation과 다른 노출된 epitope를 가진 p53이 발현이 되어 항체가 달라질 때마다 다른 층에서 발현된다는 연구도 있었다.10) 결과를 분석하여 볼 때 진주종에서의 p53의 발현이 2.2%에서 51.6%까지 광범위하게 나타났는데 이는 진주종을 얻을 때의 시기가 진주종의 성장기인지, 휴지기인지에 따라서 발현에 차이가 있었을 것으로 생각이 된다. 진주종의 종류(후천성, 선천성, 재발성)에 따라서도 분석을 시도하였지만 의미있는 차이는 찾을 수 없었다. Ki67과 p53의 관계는 정상 피부와 과증식성을 보이는 양성피부병변(lichen planus, seborrheic keratosis, chronic dermatitis, psoriasis)을 가진 환자의 피부에서 연구한 바에 의하면 정상 피부에서의 Ki67양성 정도는 1∼3%, chronic dermatitis의 경우 4∼17%로 mitosis가 많은 피부병변에서 Ki67의 과발현을 확인할 수 있었으며, p53의 양성 정도가 높을수록 Ki67의 양성 정도가 의미 있게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.2) 본 연구에서 p53의 발현과 Ki67의 발현이 모두 같은 단계인 기저층과 유극층에서 관찰되었으며 중이 진주종에서 정상피부에 비해 높게 나타난 것은 피부에서와 같이 진주종에서도 각질형성세포의 과증식이 p53의 발현을 유도했음을 시사한다. 그러나 cell cycle과 관련되어 나타나는 단백질인 Ki67과 G1 block을 유도하는 p53이 같이 증가하는 것은 역설적으로 이에 대한 해석이 필요하다. 결과를 분석하여 보면 Ki67은 정상피부에 비하여 3배정도 증가한 데 비해 p53은 20배 이상 증가하였는데 p53이 최대로 과발현되어도 많은 수의 잠재적인 증식세포를 다 억제하지는 못했기 때문에 두 단백질이 동시에 증가하였다고 생각할 수 있을 것이다. 14) p53의 발현은 악성조직에서는 5% 이상을 일반적으로 양성으로 판독하고 있으나 이번 연구에서는 다른 양성조직에 대한 연구들1)11)13)에서와 같이 하나라도 염색이 된 세포가 관찰되면 양성으로 간주하였으며 500개의 상피세포를 세어 전체 상피세포에 대한 백분율로 염색의 정도를 표시하였다. 고사는 괴사(necrosis)와 달리 생리적이며 라이소솜 효소의 유리가 동반되지 않으며 DNA의 파괴도 보다 규칙적으로 일어나게 된다. 생화학적 특성은 핵의 DNA가 Ca2+-dependent endonuclease에 의해 수백 개 또는 수천 개의 염기 쌍으로 이루어져 있는 oligonucleosome으로 조각화(fragmentation)되는 것으로 이 특성을 이용하여 괴사와 구별하게 된다. 과거에는 광학 현미경이나 전자 현미경을 이용하여 핵 염색질의 농축을 발견하거나, 세포막의 blebbing 또는 세포 용적의 감소 등을 확인하는 방법을 사용하기도 하였으며, DNA agarose gel electrophoresis, cytofluorimetric analysis of DNA content, 3H-thymidine incorporation and trypan blue dye exclusion test 등의 방법 등을 사용하였으나 최근에는 고사의 생화학적인 특성을 그대로 이용하여 조직절편 자체에서 DNA의 조각화를 확인하는 방법인 TUNEL(Terminal dUTP Nick End Labeling)법을 많이 사용하고 있다. 단일 세포에서도 고사를 관찰할 수 있는 TUNEL방법은 DNA의 3-OH말단부에 terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)의 특수한 결합에 의해 polydeoxynuleotide polymer의 합성을 유발시키고 이러한 신호는 avidin-peroxidase에 의해 증폭되어 광학 현미경하에서 관찰할 수 있다. 이 반응은 특이하게 고사가 발생하는 장소에 위치하는 핵에만 염색이 되며 이 과정은 핵의 주변부에서 시작되어 점차 덩어리를 형성해 간다. 보통 정상 피부에서는 기저층에서 각질층으로 분화되어 가는 과정에서 세포의 형태가 편평해지며 핵이 소실되는데 TUNEL염색을 하면 중층상피의 가장 바깥쪽, 즉 과립층에 존재하는 각질형성세포의 핵에만 염색이 관찰된다. Koba 등의 연구에서는 진주종에서 TUNEL염색을 이용하여 고사를 확인하였는데 고막, 외이도 상피, 후이개 상피, 진주종 조직을 비교하였을 때 염색의 정도가 서로간의 유의한 차이를 보이지는 않았다고 하였다.16) 본 연구에서는 결과를 판독할 때 Apoptag 을 이용한 염색과 염색이 되지 않았지만 육안으로 확인할 수 있는 특징적인 고사세포들을 모두 포함하였다. Apoptag 을 이용한 방법으로는 과립층에서 세포형태의 변화가 오기 전에 일어나는 고사의 과정을 민감하게 발견할 수 있지만 고사가 관찰되는 세포보다는 훨씬 적은 수에서 염색이 되었다. 그 이유로는 고사의 말기로 가면 karyorrhexis나 karyolysis에 의해 핵내물질이 없어지기 때문이라고 하였으며,13) 이러한 이유로 양성으로 염색된 세포와 핵내물질이 형태학적인 변화를 보인 세포를 모두 포함시키는 것이 타당하다고 생각된다. 결론 이번 연구에서 중이진주종에서의 각질형성세포의 과증식을 Ki67의 과발현을 통해 확인하였으며 이러한 과증식에 연관되어 일어나는 p53의 발현을 관찰하였다. 이는 과증식이 p53의 과발현을 유도하게 된다는 기존의 연구결과들을 뒷받침하여 준다고 하겠다. TUNEL염색법을 이용하여 중이 진주종에서 고사가 활발히 일어남을 확인할 수 있었는데, 이는 진주종에서의 각질의 축적이 증가된 고사에 의해 이루어지는 것을 증명하며 p53의 과발현이 이에 동반되어 나타나는 것은 이 과정에 p53이 관여함을 시사한다고 생각되며, 향후 중이 진주종에서의 p53의 mRNA 단계에서의 과발현의 확인과 중이 진주종의 발생과 진행에 작용하는 역할에 대한 연구가 필요할 것으로 사료되었다.
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