The Inhibitory Effect of Pamidronate Disodium on the Bone Resorption Using Fetal Rat Calvarial Bone Culture

Chung, Jong Woo; Chang, Hee-Jong; Won, Jun Yeon; Park, Jung Hyeog; Seo, Seock Bum; Kim, Hyung Jong; Yoon, Tae Hyun

Original Article

Middle Ear Diseases

Korean Journal of Audiology 1998;2(1):50-53.

The Inhibitory Effect of Pamidronate Disodium on the Bone Resorption Using Fetal Rat Calvarial Bone Culture

Jong Woo Chung¹, Hee-Jong Chang¹, Jun Yeon Won¹, Jung Hyeog Park¹, Seock Bum Seo¹, Hyung Jong Kim², Tae Hyun Yoon¹

¹Department of Otolaryngology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, Seoul
²Department of Otorhinolaryngology, Kangdong Sacred Heart Hospital, Hallym University College of Medicine, Seoul, Korea

태아 쥐 두개골 조직배양을 이용한 Pamidronate Disodium의 골흡수 억제효과

정종우^¹^, 장희종^¹^, 원준연^¹^, 박정혁^¹^, 서석범^¹^, 김형종^²^, 윤태현^¹

^¹울산대학교 의과대학 아산재단 서울중앙병원 이비인후과학교실
^²한림대학교 의과대학 강동성심병원 이비인후과학교실

Abstract

Pamidronate is a drug classified as bisphosphonate which is strong inhibitor of bone resorption. In this study, authors aimed to evaluate the effectiveness of pamidronate disodium on the inhibition of bone resorption. The fetal rat calvarial bones were obtained from the Ca⁴⁵-injected pregnant rats and cultured in the 37°C incubator with 95% O₂ and 5% CO₂. The culture supernatants were collected and the Ca⁴⁵ radioactivity was measured using beta-ray scintillation counter after adding parathyroid hormone (PTH) and pamidronate disodium to the culture media. The amount of released Ca⁴⁵ increased in the culture media with PTH as concentration-dependent manner. Pamidronate disodium inhibited PTH-induced release of Ca⁴⁵ in its concentration of 10^-8, 10^-7 and 10^-6M. This study suggested that pamidronate disodium can inhibit the bone resorption in vitro condition. This will provide a new applicable method in the inhibition of cholesteatomatous bone resorption.

Keywords: Bone resorption;Pamidronate;Bisphosphonate;Calvarial bone culture;Cholesteatoma;Calcium release.

서론 만성 진주종성 중이염에서 합병증을 유발하는 가장 큰 요인인 골파괴에 대한 원인으로 여러 학설들이 제시되어 왔는데, 그 중 파골세포에 의한 골흡수가 널리 알려져 있다.1-4) 골조직의 비정상적인 흡수를 일으키는 진주종은 청력소실, 전정기능저하, 만성염증, 뇌합병증 등을 유발하게 되므로 이러한 골흡수를 방지하여 진주종성 중이염의 진행을 억제시키고 합병증을 예방할 수 있는 인자들에 대한 연구에 관심이 모아지고 있으며, 그 중 골흡수에 대한 강력한 억제인자로 알려진 bisphosphonate계 약물들에 대한 연구들이 새로이 시도되고 있다.5) Bisphosphonate계 약물들은 Paget씨병, 악성종양과 동반되는 과칼슘혈증, 악성종양의 골전이, 골다공증 등과 같이 골조직의 변화율이 높은 질환들에서 임상적용되고 있으며6-8) 상당한 효과를 보이는 것으로 보고되고 있다.9) Bisphosphonate계 약물은 inorganic pyrophosphate의 유사체로서 파골세포에 의한 골흡수를 억제시키는 능력을 가진 새로이 개발되고 있는 약물로서, 초기 약제인 etidronate가 골다공증의 치료에 1971년 최초로 적용되었으며,7) 그 후 개발된 alendronate와 pamidronate는 파골세포의 생육성을 억제시켜서 골흡수를 억제하며 이를 통하여 골밀도를 상승시키고 골절의 빈도를 감소키는 결과를 보였다.10) 저자들은 bisphosphonate계 약물의 일종인 pamidronate를 태아 쥐 두개골 배양액에 넣어 이에 따르는 방사성 칼슘유리율의 변화를 관찰함으로써, 이 약물이 골흡수에 미치는 영향을 평가하고자 본 연구를 시행하였다. 재료 및 방법 태아 쥐의 두개골 조직배양 임신한 쥐(Spraque-Dawley, Charles River Japan Inc.)에서 임신 17일째 Ca45(Amersham, USA)를 피하주사하고 24시간 후 태아 쥐를 적출하여 두개골을 얻었다. 두개골을 반으로 분리하여 10% Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM, GibcoBRL, USA)에 넣고 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. Ca45의 방사능과 칼슘 유리율의 측정 배양 후 각각 1, 2, 3일째에 배양상층액을 얻어서 cocktail solution 5 ml를 넣은 후 베타선 섬관계수관(Packard, USA)에서 방사능을 측정하였다. 배양액의 칼슘유리양을 측정하고 마지막으로 남아있는 두개골을 2N HCl에 넣어 24시간 동안 탈석회화한 후 같은 방법으로 측정하여 잔존 칼슘양을 측정하였다. 칼슘유리율은 전체 칼슘양 중 각 시기 동안에 유리된 칼슘양의 비율로 구하였다. 실험결과는 student’s t-test를 이용하여 통계처리하였다. 사용한 용액 부갑상선 호르몬(Parathyroid hormone, PTH, Sig-ma, USA)이 각각 10 - 8, 10 - 7, 10 - 6, 10 - 5 포함된 배양액을 사용하여 PTH에 의한 칼슘유리율을 측정하였고, 음성대조군으로는 PTH가 포함되지 않은 배양액을 이용하였다. Pamidronate의 효과를 알아보기 위하여 PTH가 10 - 6M 포함된 배양액에 pamidronate disodium(Ciba-Geigy, Switzerland)를 각각 10 - 8, 10 - 7, 10 - 6M의 농도로 투여한 후 칼슘유리율을 측정하였고, 음성대조군으로는 PTH와 pamidronate가 포함되지 않은 배양액을 이용하였다. 결과 3일간의 칼슘유리율은 대조군에서 평균 31.1%였고, PTH를 10 -8M 추가했을 때 34.2%, 10 - 7M일 때 36.8 %, 10 - 6M일 때 40.4%, 10 - 5M일 때 42.0%로 PTH의 농도에 따라 유의하게 증가되었다(Fig. 1). PTH를 10 - 6M과 pamidronate를 같이 투여한 후 측정한 칼슘유리율은 대조군 36.5%, PTH 10 - 6M 투여군 42.8%였으며 Pamidronate 투여군은 10 - 8M, 10 - 7M, 10 - 6M 각각 33.5%, 28.1%, 21.4%로 pamidronate의 농도에 따라 유의하게 감소하였다(Fig. 2). 고찰 본 연구결과 골흡수를 증가시키기 위해 PTH를 투여했을 때, PTH의 농도가 증가할수록 칼슘유리율이 증가하였는데, PTH는 골형성세포에 작용하여 cytokine과 같은 파골세포에 의해 골흡수를 매개하는 인자들이 생성을 촉진시킨다고 알려져 있으며,11) 골배양조직에서 PTH의 투여에 의해 칼슘유리율이 증가함은 많은 실험결과들에 의해 알려져 있다.1)5) 파골세포의 골흡수에 대한 in vitro 연구에서는 태아 또는 신생쥐의 골조직 배양방법이 가장 흔히 쓰여지고 있으며, 미리 방사선 칼슘을 투여하고 유리되는 방사성 Ca45양이 골흡수의 지표로 이용된다. 5)12)13) 이비인후과 영역에서 bisphosphonate계 약물을 대상으로 한 연구는 최근에 시작되었는데, Richardson과 Chole5)의 연구에 의하면 골배양조직에 risedronate를 투여하고 흰쥐의 태아 두개골조직을 배양하였을 때, PTH에 의해 증가된 칼슘유리율이 현저히 감소하였고, 또한 약물을 신생 흰쥐에 피하주사하였을 때도 골배양액의 칼슘유리율이 감소한다고 보고하였다. 본 연구에서는 pamidronate를 투여하였을 때 PTH에 의한 골흡수가 pamidronate의 농도의존적으로 억제되었다. 이러한 결과는 pamidronate가 PTH의 주요역할인 파골세포의 활성도 증가를 억제하기 때문일 것으로 생각할 수 있다. 특히 Lorenzo 등14)은 PTH와 bisphosphonate는 파골세포 형성과정의 동일한 단계에 적용할 것이라고 하였으므로 pamidronate의 작용기전과 부합하는 결과로 생각된다. 그리고 배양액만을 이용하였던 음성대조군에서 3일간 약 36%의 칼슘유리율을 보이는데 비하여 pamidronate 10 - 7M과 10 - 6M을 투여한 군에서는 각각 28.1%, 21.4%로 더 낮은 칼슘유리율을 보였다. 이는 pamidronate가 파골세포의 생육성을 억제하는 효과를 가지고 있으므로 PTH에 의한 파골세포의 활성도 증가상태가 아닌 자연적인 파골세포의 골흡수능력도 pamidronate가 억제할 수 있다는 것을 시사한다. 결론 본 연구를 통하여 태아 쥐 두개골 조직배양에서 pamidronate disodium의 골흡수억제효과가 증명되었고, 이를 통하여 중이진주종에 의한 골흡수현상을 방지하는 연구가 진행되어야 할 것이다.
REFERENCES
1) Kurihara A, Toshima M, Yuasa R, Takasaka T. Bone destruction mechanisms in chronic otitis media with cholesteatoma: Specific production by cholesteatoma tissue in culture of bone-resorbing activity attributable to interleukin-1 alpha. Ann OOtol RhinolLaryngol 1991;100(12):989-98. 2) Ahn JM, Huang CC, Abramson M. Interleukin-1 causing bone destruction in middle ear cholesteatoma. Otolaryngol Head Neck Surg 1990;103(4):527-36. 3) Chole RA. Osteoclasts in chronic otitis media, cholesteatoma, and otosclerosis. Ann Otol Rhinol Laryngol 1988;97:661-6. 4) Uno Y, Saito R. Bone resorption in human cholesteatoma: Morphological study with scanning electron microscopy. Ann Otol Rhinol Laryngol 1995;104(6):463-8. 5) Richardson AC, Tinling SP, Chole RA. Risedronate activity in the fetal and neonatal mouse. Otolaryngol Head Neck Surg 1993;109(4):623-33. 6) Nishikawa M, Akatsu T, Katayama Y, Yasutomo Y, Kado S, Kugal N, et al. Bisphosphonates act on osteoblastic cells and inhibit osteoclast formation in mouse marr-ow cultures. Bone 1996;18(1):9-14. 7) Singer FR, Minoofar PN. Bisphosphonates in the treatments of disorders of mineral metabolism. Adv Endocrinol Metabol 1995;6:259-88. 8) Watts NB. Treatment of osteoporosis with bisphosphonates. Rheum Dis Clin North Am 1994;20(3):714-34. 9) Patel S. Current and potential future drug treatments for osteoporosis. Ann Rheum Dis 1996;55(10):700-14. 10) Ricata AA. Bisphosphonate therapy. Am J Med Sci 1997;313(1):17-22. 11) van der Pluijm G, Lowik CW, de Groot H, Alblas MJ, van der Wee-Pals LJ, Bijvoet OL, et al. Modulation of PTH-stimulated osteoclastic resorption by bisphosphonates in fetal mouse bone explants. J Bone Miner Res 1991;6(11):1203-10. 12) van Beek E, van de Luit MO, van der Wee-Pals L, Bloys H, van de Bent C, Papapoulos S, Lowic C. Effects of experimental conditions on the release of 45calcium from prelabeled fetal mouse long bones. Bone 1995;17(1):63-9. 13) Cochran DL, Rouse CA. The effect of conditioned medium from connective tissue fibroblasts and epithelium on calcium release from mouse calvarial organ culture. Archs Oral Biol 1993;38(1):61-5. 14) Lorenzo JA, Raisz LG, Hock JM. DNA synthesis is not necessary for osteoclastic responses to parathyroid hormone in cultured fetal rat long bones. J Clin Invest 1983;72:1924-9.