Functional Recovery and Role of HSP72 after Kainic Acid Instillation into Guinea Pig Cochlea

Seok, Youn Sik; Lim, Hyun Ho; Jung, Hak Hyun; Suh, Han Kyu; Cha, Heong Eog; Hwang, Soon Jae

Original Article

Auditory and Vestibular Disorders

Korean Journal of Audiology 1998;2(2):118-123.

Functional Recovery and Role of HSP72 after Kainic Acid Instillation into Guinea Pig Cochlea

Youn Sik Seok^1,2, Hyun Ho Lim¹, Hak Hyun Jung¹, Han Kyu Suh¹, Heong Eog Cha², Soon Jae Hwang¹

¹Department of Otolaryngology-Head Neck Surgery, Collegeof Medicine, Korea University, Seoul
²Gachon Medical College, Gil Medical Center, Inchon, Korea

기니픽 와우에서 Kainic Acid 주입 후 청력회복 및 HSP72의 역할

석윤식^{¹^,²}^, 임현호^¹^, 정학현^¹^, 서한규^¹^, 차흥억^²^, 황순재^¹

^¹고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
^²가천의과대학부속 길병원 이비인후-두경부외과학교실

Abstract

It has recently proposed that excitotoxicity is involved in a variety of cochlear disease such as sudden deafness and noise-induced hearing losses. Heat shock protein (HSP), which are known to have a protective role against various cellular stresses are induced by excitotoxicity in many neuronal populations. This study was performed to determine the functional recovery after kainic acid induced excitotoxicity and to understand the mechanism of temporary threshold shift (TTS) by localizing the expression of HSP in the guinea pig cochlea. Six Guinea pigs were treated with kainic acid (100 μM, local injection into the round window) and auditory brainstem responses (ABRs) were checked at 0, 1, 2, 4, 8 and 24 hours after injection of kainic acid. Ten animals were sacrificed at 2, 4, 8, 12 and 24 hours after injection. Surface preparations and frozen sectioned cochlear tissues were used for immunocytochemistry using monoclonal anti HSP 72 antibody to detect HSP 72 expression. The ABRs showed about 30 dB threshold shift until 8 hours of injection and after that, auditory function was slowly recovered and returned to pretreatment level by 24 hours. In immunocytochemistry HSP 72 immunoreactive staining was observed in the cochlear tissues of 4 and 8 hours after injection and was not seen after 12 and 24 hours after injection. Immunostaining was mainly seen in inner hair cells and outer hair cells showed very weak or no immunostaining. These results suggested that expression of HSP 72 in inner hair cells may play a role in functional recovery against kainic acid induced excitotoxicity of cochlea.

Keywords: Kainic acid;TTS;HSP;Cochlea;Guinea pig.

서론 Kainic acid는 흥분성 아미노산인 glutamate의 유사체로서 신경퇴행성질환 및 간질의 원인을 연구하는 모델에 사용되어 왔으며, 이러한 흥분성 신경독성의 기전으로는 신경의 과흥분으로 인한 세포의 저산소이 원인인 것으로 생각되고 있다.1-3) 중추 신경계에서와 마찬가지로 와우조직에서도 흥분성 신경전달물질의 과분비로 인한 독성에 관한 연구가 진행되고 있다. 와우조직으로 kainic acid를 국소 투여하면 청각신경의 시냅스 후부위를 파괴시켜 와우전위(cochlear potential)의 완전 소실을 초래하게 되나 5일 경과 후에 새로운 시냅스의 형성에 의하여 완전 회복됨이 Fuel 등에 의해 보고되었다.4) Heat shock proteins(HSP)는 열 자극 또는 그 밖의 스트레스뿐만 아니라 흥분성 신경독성에 의해 세포 내에서 생성되며, 세포의 생성, 방어 기전에 관여하는 것으로 알려져 있다.5)6) Kainic acid에 의한 열충격반응(heat shock response)의 기전에 대해서 Uney 등7)은 Kainic acid에 의해 신경의 탈분극이 발생하고 세포질내의 유리칼슘 및 세포내 칼슘의 농도가 증가함으로써 세포내 단백질분해효소의 활성화, 미토콘드리아 막전위의 소실, 세포 삼인산아데노신(cellular ATP pools)의 결핍으로 세포손상이 유발된다고 하였다. Lim 등8)의 연구에 의하면 흰쥐의 와우에서 강한 소음자극 후 HSP72가 발현되었으며, 이것은 소음자극 후의 일시적 청각역치 상승에 관계가 있음을 제시하였다. 본 연구에서는 신경흥분독소인 kainic acid를 기니픽 와우에 국소 주입한 후 HSP72의 발현여부와 청력의 기능적 회복에 있어서 HSP72의 역할에 대하여 알아보고자 하였다. 재료 및 방법 대상 동물의 선정과 실험의 설계 고막소견이 정상이고 이개반사(Preyer's reflex)가 양성인 체중 250∼300 gm의 백색 기니픽 16마리를 대상으로 하였다. 기니픽 6마리는 우측귀에 kainic acid 주입 후 뇌간유발반응청력검사를 시행하였으며, 좌측귀는 대조군으로 하였다. 기니픽 10마리는 kainic acid 주입 후 각 시간대별로 2마리씩 면역조직화학염색을 시행하였다. 모든 수술적 처치와 청력검사는 마취(ketamine 40 mg/kg IM, xylazine 10 mg/kg IM)하에 시행되었으며, 열 램프를 이용하여 직장온도를 38.5℃±1℃로 유지하였다. Kainic acid의 주입 무균조작하에 이개후 측방부에 2 cm의 피부절개를 가하여 외이도 후벽의 상반부로부터 측두골 골포(bul-la)를 노출시킨 후 천공기(drill)과 골겸자(bone rongeur)를 이용하여 2.0∼3.0 mm의 구멍을 만들어 수술 현미경으로 와우 기저회전의 말단부에 위치한 정원창을 확인하였다. 27 gauge의 주사침을 이용하여 100 μM의 kainic acid 0.2 ml를 정원창에 주입하였다(Fig. 1). 젤폼을 이용하여 정원창부위를 덮어 주었으며, 골포는 골랍(bone wax)으로 막은 후 절개부위를 봉합하였다. 대조군에서는 kainic acid 대신 동량의 인공외림프액(137 mM NaCl；5 mM KCl；2 mM CaCl2；1 mM MgCl2；1 mM NaHCO3；11 mM glucose, pH 7.4)을 사용하였다. 청각기능검사 Kainic acid 주입 전 및 주입 후 1, 2, 4, 8, 24시간에 뇌간유발반응청력검사를 실시하여 청력역치 변화를 관찰함으로써 청력기능을 평가하였다. 대조군에서도 마찬가지로 인공외림프액을 주입 후 같은 시간대에 청력기능을 평가하였다. 검사기계는 Bio-logic사의 Traveler Express형을 이용하였으며, 자극음은 insert-ion phone을 통하여 광역주파수대의 click음을 편측자극 하였으며, 반대측 귀는 80 dB SPL의 백색잡음으로 차폐하였고 반응파의 기록은 2 channel system으로 하였다. 전극은 intradermal needle electrode를 사용하여 활성전극을 동측의 이개하부에, 비교전극을 두정부에, 접지전극을 상대측의 이개하부에 부착하여 유발전위를 2000회 가산평균하는 과정을 거쳐 파형을 얻었다. 면역조직화학 염색 Kainic acid 주입 후 1, 2, 4, 8, 12, 24시간에 마취한 상태에서 개흉하여 심장을 노출시켰다. 좌심실의 끝 부분을 절제하고 그 사이를 통하여 굵은 주사바늘(14 gauge)을 상행대동맥에 삽입하고 우심방을 절제한 후 인산완충생리식염류(PBS)로 관류하여 혈액을 씻어 내었다. 연속적으로 약 500 ml의 4% paraformaldehyde in phosphate buffered saline(PBS)으로 약 1시간 동안 관류고정하였다. 고정된 기니픽의 두개골을 해부하여 측두골로부터 와우를 얻은 후 같은 고정액으로 정원창막을 통하여 와우를 국소 고정한 다음 하룻밤동안 후고정하였다. 고정된 와우는 실체해부현미경하에서 미세해부를 하여 바같쪽 골부를 제거하고 와우 나선 전장에 걸쳐 Corti씨 기관을 보존한 표면조직표면을 얻고 이 와우의 표면조직표면은 면역조직화학염색에 사용되었다. 면역조직화학염색법은 avidin-biotin-peroxidase complex(ABC)법으로, 요약하면 다음과 같다. 먼저 조직을 상온에서 0.3% H2O2/PBS에 10분간 처리한 후 PBS에 5분씩 3회 수세하였다. 조직내의 비특이반응을 줄이기 위하여 3% normal horse serum(＋0.3 % triton X-100＋1% BSA in PBS)에 40분간 incubation하고 PBS에 10분씩 3회 수세한 후 1차 항체(mouse monoclonal anti-glucocorticoid 수용체 antibody, 1：500)에 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. PBS에 10분씩 3회 수세한 후 2차 항체(biotin-labeled anti-mouse IgG, 1：400 in PBS)용액에 1시간 동안 처리하고 다시 PBS에 10분씩 3회 세수의 과정을 거친 후 avidin-biotinylated horseradish peroxidase(H RP) complex(Vector Lab, 1：200 in PBS)용액에 45분 동안 처리하였다. PBS에 10분씩 세차래 수세한 후 DAB에 담궈 약 3∼5분간 발색 반응을 거친 뒤 증류수로 수세한다. 와우의 표면조직표면 조직은 실체해부현미경 하에서 다시 한 회전씩 조심스럽게 분리한 후 50% glycerol in PBS용액을 점적한 slide위에 붙이고 cover glass를 덮고 광학현미경으로 관찰하였다. 결과 Kainic acid 주입 후 청력역치의 변화 뇌간유발반응청력검사에서 kainic acid 주입 전의 평균청력역치는 29±5 dB이었으며, kainic acid 주입 후 2시간까지 20∼30 dB의 감소가 있었다. 이러한 변화는 8시간까지 지속되거나 40 dB까지 감소되어 kainic acid 주입 후 8시간에는 59±4 dB의 평균청력역치를 나타내었다. 8시간 이후에는 청력기능이 서서히 회복되어 24시간에는 주입 전 상태로 회복되었다(Fig. 2). 대조군에서의 평균청력역치 변화는 전처치때와 비교시 10 dB 범위내였다(Fig. 2). Kainic acid를 주입한 실험귀 1례의 뇌간유발반응청력검사의 변화는 다음과 같다(Fig. 3). 면역조직화학염색 인공와우림프액을 주입한 대조군과 kainic acid 주입 후 2시간 경과 후의 와우조직에서 HSP72에 대한 면역염색반응은 외유모세포의 지지세포에서 관찰되었다(Fig. 4). Kainic acid 주입 후 4시간, 8시간 경과 후에는 면역반응이 지지세포에서 관찰되지 않았으며, 내유모세포에서 강하게 관찰되었고 외유모세포에서는 약하게 관찰되거나 관찰되지 않았다(Fig. 5). 이러한 면역염색소견은 8시간 경과 후의 와우조직에서 현저하게 관찰되었으며, 12시간, 24시간 경과 후에는 관찰되지 않았다. 고찰 Glutamate는 사람을 비롯한 포유동물의 와우에서 청각신호를 전달하는데 중요한 신경전달물질로 내유모세포와 제 1 형 나선신경절 세포 사이의 시냅스에 존재한다.9)10) 흥분성 전달물질인 glutamate와 그 유사체인 NMDA, kinate, AMPA, quisqualate는 신경시냅스에서 과 분비될 경우 신경독성 물질로 작용하게 된다.11) 최근에 돌발성 난청, 소음성 난청, 감각신경성 난청, 이명 등과 같은 와우 질환이 흥분성 신경독성과 관계가 있음이 보고되고 있다.12)13) 또한 돌발성 난청과 소음에 의한 손상의 경우에 종종 일시적인 청력소실 후에 회복이 되는 것을 관찰할 수 있다. 즉 청각기관은 주위 환경으로부터의 스트레스에 의하여 야기된 기능장애로부터 회복하려는 능력이 있으며, 이를 일시적 청각역치 상승(temporary threshold shift, TTS)이라 한다. TTS가 일어나는 원인은 유모세포에서의 능동적인 생체 역학적 과정의 일시적 와해 또는 부동섬모(stereocilia)의 손상 등이라고 생각되고 있으나 TTS가 일어나는 기전의 세포생물학적 배경에 관해서는 아직 잘 알려져 있지 않고 또 어떤 경우에, 어떠한 이유로 세포의 방어기전이 작용하지 못하여 영구적인 손상을 가져오는지에 대하여는 잘 모르는 실정이다. 본 연구에서 저자들은 외림프에 kainic acid를 주입 후 8시간 경과 후까지 지속되는 30 dB의 청각역치 상승을 관찰할 수 있었으며, 그 이후에는 기능적 회복이 시작되어 24시간 경과 후에는 거의 실험 전 상태로 회복되었다. Puel 등4)은 와우로의 kainic acid 국소 주입 후 감소된 청력기능이 5일 경과 후에 정상으로 회복되었으며, 이러한 청력기능의 회복은 강한 흥분성독성 물질에 의해 손상된 청각신경의 수상돌기가 재생되기 때문이라고 보고하였다. 저자들의 연구에서는 회복시기가 다른 연구에 비하여 짧았는데 그것은 다른 연구에 비하여 낮은 농도의 kainic acid를 사용했기 때문인 것으로 생각된다. 흥분성독성의 손상에 대한 또 다른 방어기전으로 생각할 수 있는 것은 heat shock protein(HSP)의 역할이다. HSP은 대단히 보존적인 세포내 단백질로서 세포에 손상을 줄 수 있는 여러 가지 스트레스(열 자극, 허혈 자극, 대사억제제, 아미노산 유사물질 등) 후에 세포 내에서의 생성이 증가되어 세포의 방어기전에 작용한다고 알려져 있다.14)15) 중추 신경 조직에서 뇌조직의 일시적 허혈, 열 자극, 신경축색의 절단 등의 자극 후에 HSP의 발현이 보고되었고, 특히 뇌조직 내로 kainic acid 투여 후 HSP70의 발현은 흥분성 신경독성에 의한 신경세포내의 변화에 대한 HSP의 역할을 가정할 수 있으며, 흥분성의 지표로 생각되고 있다.16) 말초 청각 기관에서도 열 자극,17) 일시적 허혈자극,18) 강한 소음자극8)후 HSP이 와우에서 발현되었으며, 소음 자극 후 HSP72의 발현이 일시적 청각역치 상승에서 영구적인 기능 장애로 이행되는 것을 방어한다는 가설8)로 보아 청각기관의 방어기전에도 중요한 역할을 할 것으로 생각된다. 저자들의 면역조직화학염색 결과 대조군과 kainic acid 주입 후 2시간이 경과된 와우조직에서 HS P에 대한 염색반응이 외유모세포의 지지세포에서 관찰되었다. 이러한 염색반응결과는 아무런 자극을 받지 않은 와우에서 HSP72가 지지세포 및 치간세포(interdental cell)에서 염색되었다는 Neely 등9)의 결과와 유사하였다. 기니픽 와우의 지지세포에서 HSP 72의 발현은 스트레스에 대한 지지세포의 방어적인 역할의 가능성을 시사한다. 지지세포는 반흔 형성에 관계없이 소음, 이독성 약물에 대하여 복합적인 반응을 나타내고 20)21) HSP은 이러한 반응의 한 면에서 역할을 할 것으로 생각된다. Kainic acid 주입 후 4시간, 8시간이 경과된 후의 와우조직에서 면역염색반응은 주로 내유모세포에서 관찰되었으며, 외유모세포에서는 매우 약하게 염색되거나 염색이 되지 않았고 그 이후에는 유모세포 또는 지지세포에서 반응이 관찰되지 않았다. 이상의 결과에서 kainic acid의 흥분성 독성이 내유모세포에 HSP72 의 발현을 유발하였음을 알 수 있었으며, 와우의 내유모세포에서 glutamate의 흥분성독성의 효과를 증명할 수 있었다. HSP72의 발현이 주로 4시간 또는 8시간이 경과한 후에 가장 강하게 관찰된 것으로 보아 HSP은 흥분성독성에 대하여 초기방어작용으로 작용한다기보다는 손상 후의 기능회복에 관여할 것으로 생각된다. 향후 와우조직에서 흥분성독성에 대하여 유사한 병태생리를 나타내는 다양한 조건에서의 HSP 역할에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
REFERENCES
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