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Auditory and vestibular disorders
Korean Journal of Audiology 2009;13(2):140-144.
Immunohistochemical Expression of p27Kip1 in Human Middle Ear Cholesteatoma Epithelium
Hyun-Jin Lee1, Ho Ryun Won1, Jun Yeon Hwang1, Young-Ho Hong1, Seog-Kyun Mun1, Mi-Kyung Kim2
1Departments of Otorhinolaryngology-Head Neck Surgery
2Pathology, College of Medicine, Chung-Ang University, Seoul, Korea
진주종 상피에서 p27Kip1의 면역조직화학적 발현양상
이현진1, 원호륜1, 황준연1, 홍영호1, 문석균1, 김미경2
1중앙대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
2병리학교실
Abstract

Background and Objectives: Factors progressing the cell cycle may also induce proliferation of the epithelium of cholesteatoma. Cyclin and cyclin-dependent kinase (CDK) complexes have important regulatory roles during cell cycle progression. p27Kip1, a member of the cyclin-dependent kinase inhibitors (CDKIs), plays a role in the inhibition of cell proliferation, leading to the inhibition of cyclins and CDK complexes. In this study, we aimed to investigate the expression of p27Kip1 in cholesteatoma, a disease characterized by the presence of hyperproliferative squamous epithelium. 



Subjects and Methods
Cholesteatoma tissues and retroauricular skins were collected from 19 adult patients intraoperatively. The monoclonal antibodies to p27Kip1 were used for immunohistochemical staining. The streptavidin-biotin immunoperoxidase complex method was used. The number of cells staining positive for p27Kip1 was calculated. 



Results
In the cholesteatoma, the expression of p27Kip1 was greater in the upper regions of the prickle and granular layers compared with the basal layer. In the retroauricular epithelium, it was equivalent in all layers. The labeling index of p27Kip1 was greater in the retroauricular epithelium than in the cholesteatoma. The difference between the groups was statistically significant (p<0.05). 



Conclusions
In cholesteatoma, the expression of p27Kip1 decreased more than in the sample skin and the distribution of p27Kip1 concentrated in the prickle and granular layers. This indicates the loss of cell cycle control in cholesteatoma and may be considered to be a cause of the hyperproliferative ability of the epithelium.

Keywords: Cholesteatoma;p27<sup>Kip1</sup>.

Address for correspondence : Seog-Kyun Mun, MD, Departments of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Chung-Ang University, 65-207 Hangang-ro 3-ga, Yongsan-gu, Seoul 140-757, Korea
Tel : +82-2-748-9847, Fax : +82-2-792-6642, E-mail : entdoctor@freechal.com


서     론

진주종성 중이염의 병리학적 특성은 상피세포의 증식과 각질세포로의 분화인데, 이와 같은 현상을 이해하고자 진주종 상피에서 발현되는 단백질 중 세포의 증식 표지자인 Ki-67, proliferation cell nuclear antigen(PCNA) 등을 이용한 연구가 보고되어져 왔다.1,2) 그러나 최근의 연구에서 세포의 고사를 유발시키는데 관여하는 p53 단백질이 진주종의 상피에서 정상 상피보다 많이 관찰된다는 보고가 있었는데,3) 이는 종양세포와는 달리 세포의 증식이 어느 정도 활발하게 일어나다가 중단된다는 것을 의미하므로, 세포분열의 전과정에서 발현되는 표지자인 Ki-67이나 PCNA로는 세포분열의 특정 주기에서 발현되는 표지자보다 과증식을 설명하기에는 부족한 부분이 있다. 
세포주기의 조절에 있어서 단백질의 인산화 과정은 중요한 요소로서 이 과정이 차단되면, 세포주기 G1기에서 S기로 진행을 하지 못하여 DNA 합성이 억제된다.4) Cyclin과 cyclin-dependent kinase(CDK) 복합체는 이러한 단백질의 인산화 과정에 관여함으로써 세포주기 진행을 유도하는데, 세포주기 진행을 억제하는 cyclin dependent kinase inhibitors(CDKI)에 의해 조절을 받게 된다.4,5) CDKI 중 Cip/Kip군에 속해있는 것들은 p21Cip1, p27Kip1, p57Kip2 등이 있으며 cyclin D-CDK4/6, cyclin E-CDK2, cyclin A-CDK2 등 다양한 cyclin과 CDK 복합체를 억제하는데, 이 중 p27Kip1은 cyclin E-CDK2 복합체와 결합하여 세포주기의 G1기에서 S기로의 진행을 조절하는 CDKI로 알려져 있다.6,7) 세포주기 진행을 억제하여 세포증식을 조절하는 p27Kip1은 여러 암종에서 종양의 진행과 생존율에 대하여 반비례 관계를 보이고, 유방암이나 대장암 등의 악성 종양에서 발현이 감소된다고 보고되었다.8,9)
본 연구에서는 환자들로부터 얻어진 중이 진주종 상피와 후이개 부위 정상 상피를 대상으로 면역조직화학적 염색 방법을 통한 p27Kip1의 발현을 측정함으로써, 세포주기의 진행에 관여하는 p27Kip1과 진주종 상피 세포의 과증식에 대한 연관성을 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

대   상
2007년 8월부터 2008년 7월까지 본원 이비인후과에서 진주종성 중이염으로 진단을 받고 수술을 시행받은 환자 중 19명을 대상으로 수술시 얻은 중이 진주종 상피를 실험 재료로 사용하였다. 남자 9명, 여자 10명이며, 연령 분포는 16세에서 66세로 평균 연령 47.5세였다. 대조군으로는 수술시에 동측 후이개 절개부위에서 채취한 정상 상피를 사용하였는데, 측두선(temporal line) 하단에서 외이도 후방으로 가상의 수평선을 그어 1×1 cm2 넓이로 상피의 피하층(subcutaneous layer)까지 포함시켜 획득하였다. 채취한 각각의 조직은 수술시에서 즉시 10% 포름알데하이드로 고정하였다. 

방   법

면역조직화학적 염색
고정된 조직은 실험실에서 파라핀 포매조직을 만들었다. 각각의 파라핀 포매조직에서 4
~5 μm 두께의 절편을 박절하고 streptavidin-biotin immunoperoxidase complex 방법을 이용하여 면역조직화학적 염색을 시행하였다. Xylene으로 탈파라핀화 시킨 후, 무수 알코올, 90%, 75% 및 50% 알코올에서 차례대로 함수과정을 거쳐서 증류수에 5분간 수세하였다. 내인성 과산화효소의 활성을 억제하기 위해 0.5% hydrogen peroxide에 10분간 처리 후 증류수로 수세하였다. 항원성 회복을 위하여 10 mM citrate(pH 6.0) 완충액에 담그고 5분간 2회 극초단파 처리 후 실온에서 냉각시키고, 50 mM Tris 완충용액(pH 7.5)으로 수세하였다. 면역조직화학염색의 비특이성 반응을 제거하기 위해 30분간 염소 혈청으로 배양하고, 여분의 용액을 제거한 다음 일차항체인 p27Kip1(Neomarkers, Fremont, CA, USA, mouse monoclonal, 1 : 100)을 실온에서 1시간 반응시켰다. 상온에서 Tris 완충용액으로 5분간 3회 수세한 다음 biotin이 부착된 이차항체(Zymed Co., San Francisco, USA)에 20분간 적용 후, streptavidin과 결합한 과산화 효소 복합체를 가하여 20분간 반응시킨 후, AEC chromogen(3-amino-9-ethylcarbazole) 용액으로 발색하고 Mayer's hematoxylin으로 대조 염색을 실시하여 광학현미경으로 관찰하였다. 

면역조직화학적 염색의 판정
p27Kip1 염색은 세포내 핵이 선명하게 적갈색으로 염색되는 경우를 양성 반응으로 판정하였고, 염색이 되지 않은 경우를 음성 반응으로 판정하였다. 후이개 절개 부위에서 채취한 정상상피에서 p27Kip1의 발현을 대조군으로 정하고, 염색이 된 진주종 상피를 기저층(basal layer), 기저주위층(parabasal layer), 유극층(prickle layer), 과립층(granular layer), 각질층(horny layer)으로 분류하였다. p27Kip1 염색 정도는 조직 내에서 양성 반응을 보이는 세포가 차지하는 백분율을 측정하여 1% 미만은 음성(0), 1
~25%는 1+, 26~50%는 2+, 51~75%는 3+, 76~100%는 4+로 등급을 나누었다. 또한 p27Kip1 염색의 분석을 위해 병변에서 강하게 염색된 3부위를 무작위로 정해 400배 현미경하에서 관찰한 후 컴퓨터 모니터상에서 각 부위당 200개의 세포를 계수하고 이 중 양성 반응을 보인 세포수의 백분율을 구하는 방법을 시행하여 이의 평균치를 양성 표지지수(labeling index)로 삼았다. 그리고 양성 반응을 보이는 세포의 분포 양상을 관찰하기 위해 다음과 같이 분류하였는데, 양성 반응을 보이는 세포들이 조직 내에서 전층에 걸쳐 골고루 분포하면 미만형(diffuse pattern), 양성 반응을 보이는 세포가 과립층 및 유극층에서만 비교적 균일하게 반응하는 경우를 변연형(marginal pattern), 그 외에 조직 내에서 일부에서만 분산되어 제한적으로 분포하면 국소형(scat-tered pattern)으로 간주하였다.

통계학적 분석
후이개 부위 정상 상피와 중이 진주종 상피에서 표지지수의 차이의 통계학적 유의성을 student t-test로 분석하였다. 통계프로그램은 SPSS(version 15.0, SPSS Inc, Chicago, IL, USA)을 사용하였고, p<0.05일 때 통계적으로 유의하다고 하였다. 

결     과

후이개 부위 정상 상피세포에서 p27Kip1의 발현은 전층에서 골고루 분산되어 나타났으며, 특히 과립층과 유극층에 비해 기저층과 기저주위층에서 더 강하게 발현되었다. 중이 진주종 상피에서 p27Kip1의 발현은 후이개 부위 정상 상피세포와는 다르게 기저층과 기저주위층에서는 거의 관찰되지 않았으나, 과립층과 유극층에서 약하게 분산되어 나타났다(Table 1, 2).
두 군에서 19예 중 p27Kip1 양성 표시지수는 후이개 부위 정상 상피에서 50.0%±20.2이었고, 진주종 상피에서는 13.9%±10.2이었으며, 두 군의 차이는 통계적으로 유의하였다(p=0.000)(Table 3).
후이개 부위 정상 상피세포에서 양성 반응을 보이는 세포들의 분포 형태는 19예 모두 미만형으로 보였다. 중이 진주종 상피에서는 변연형은 13예, 국소형은 6예이었고, 미만형은 1예도 없었다(Table 3)(Fig. 1, 2). 


고     찰

진주종성 중이염의 병리학적 특징인 각질세포 과증식의 원인은 아직까지 확실히 밝혀져 있지 않으나 증식 조절유전자의 기능 이상이나,10) 간질층에 침윤된 염증세포에서 분비되는 면역물질에 의하여 유발된다고 여겨지고 있다.11,12) 최근에는 진주종 상피의 과증식을 증명하기 위하여 Ki-67, PCNA 등의 증식 표지자들을 이용하여 과증식에서 조절의 상실에 초점을 둔 연구가 보고되고 있다.1,2) 그러나 상기한 표지자들은 휴지기 이외의 모든 세포주기 기간에 발현되는 표지자라는 단점이 있다. 본 연구에서 사용한 p27Kip1은 cyclin E와 CDK2 복합체와 결합하여 CDK의 활성도를 약화시키는 CDKI 중 한 가지로서 cyclin과 CDK 복합체를 억제하여 세포주기 진행을 조절할 수 있는데, 특히 G1기에서 S기로의 진행을 억제하여 세포주기를 정지시키는 것으로 알려져 있다.6,13) Matsushime 등14)과 Meyerson 등15)이 보고한 상피세포의 증식과 관련된 CDK2 및 CDK4에 대한 연구에 따르면, 세포주기 진행의 기전은 cyclin D의 발현으로 시작되어 활성화된 CDK4와 복합체를 형성하여 Rb 단백질을 인산화시키고, 인산화된 Rb 단백질에 의해 유전자의 복제가 유도되어 세포주기는 S기로 진행한다고 하였다. 또한 p27Kip1은 상기의 세포주기 진행에서 cyclin D-CDK4와 cyclin E-CDK2 복합체가 Rb 단백질을 인산화 시키지 못하게 억제하여, 그 결과 상피세포는 S기로 진행이 차단되어 증식이 억제된다고 하였다.16,17) 따라서 저자들은 이전의 연구들에서 사용한 표지자들과 다르게 p27Kip1은 세포주기 중 특정기간에서 발현되어 세포주기 진행을 억제하므로, 진주종에서 p27Kip1의 발현여부를 확인함으로써 상피세포 과증식의 기전 중에서 세포주기 조절의 이상과의 연관성을 나타내줄 수 있는 표지자라고 생각하였다.
Bujia 등18)은 진주종 상피에서 각질세포가 상피의 95% 이상을 차지하는데, 기저층 및 기저주위층에 있는 각질세포는 정상 피부에 비해 높은 증식력을 보여주지만, 상부로 이동하면서 서서히 증식력이 사라져 간다고 했다. p27Kip1은 휴지기 세포의 핵에서 발견되므로 분화하는(differentiating) 각질형성세포에서는 증가된 발현 양상이 관찰되지만 분열하는(dividing) 세포에서는 발현이 감소된다.16) 따라서 정상적인 조직에서의 발현 양상은 분화하는 세포가 많이 모여 있는 기저층과 기저주위층에서는 발현이 증가되지만 분열하는 세포가 주로 존재하는 과립층이나 유극층에서는 발현이 감소된다.16,17) 본 연구에서 p27Kip1의 발현 양상은 후이개 부위 정상 상피와 중이 진주종 상피간에 차이가 있었다. 후이개 부위 정상 상피인 경우는 전층에서 발현되었고 기저층에서 유극층으로 갈수록 점점 발현이 약해지는 경향을 보였지만, 중이 진주종 상피인 경우에는 기저층이나 기저주위층에서는 거의 발현이 되지 않았고, 과립층에서 발현된 뒤 유극층에서 약화되었다. 이는 진주종에서는 기저층과 기저주위층에는 휴지기에 머무르는 세포의 수가 거의 없고 세포들의 과증식이 이루어지게 된다는 것을 의미하기 때문에, p27Kip1이 발현되지 않는 것이 진주종을 유발시키는 하나의 원인으로 생각할 수 있다.
본 연구에서 p27Kip1의 양성 표시지수는 중이 진주종 상피에서 후이개 부위 정상 상피보다 3.5배 정도 약하게 관찰되었고, 이는 통계학적으로 유의하게 감소된 소견이다. Fredersdorf 등8)의 보고에 의하면 다양한 상피 종양세포에서 p27Kip1의 결함은 세포의 조절되지 않는 증식과 악성변화를 초래할 수 있다고 하였는데, 이와 같이 p27Kip1의 양성 표시지수가 감소하게 되면, 중이 진주종 상피에서 휴지기의 각질세포가 감소되어 증식 억제가 조절되지 않는다는 것을 암시하며, 정상 상피와의 감별에 도움을 줄 수 있을 것이라고 생각된다. 또한 p27Kip1은 휴지기에서는 높은 수준이지만 세포분열이 시작되면 감소하는데,6) 세포분열시 p27Kip1의 감소하게 되면, 상피세포에서 증식 억제 수준이 낮아짐으로써, 정상 상피에서 과증식이 일어나거나, 진주종 상피가 더욱 진행하는 결과가 나타날 수 있다. 이러한 진주종을 야기하는 세포 분열의 조건이 어떠한 것인지 밝혀진 바는 없으나, Polyak 등7)과 Toyoshima와 Hunter13)의 보고에 의하면 CDK2와 CDK4는 염색체 12q13에 위치하고 p27Kip1는 염색체 12p13에 위치하므로 염색체 변이에 의해 동일 염색체에 존재하는 CDK와 p27Kip1간의 변이가 발생할 수 있다고 하였고, Kojima와 Tanaka 등19,20)의 연구에서는 심한 염증 반응이 있을 경우 상피하부의 염증세포와 상피세포가 다양한 cytokine을 생산하여 상피세포의 증식을 가속화시킨다는 보고로 미루어, 진주종 상피의 기저층 및 기저주위 층에서 상피세포의 과증식은 진주종성 중이염에서 상피하부의 염증 반응으로 p27Kip1의 기능부전을 초래하고 상피에서 발현되는 cytokine의 자극이 증가되어 cyclin과 CDK 복합체의 발현을 활성화 시키면서 유도되는 것으로 생각된다.
본 연구에서 p27Kip1에 양성 반응을 보이는 세포들의 분포 형태는 정상 상피에서는 미만형의 분포양상을 보였고, 중이 진주종 상피는 변연형이나 분산형의 분포양상을 나타내어 뚜렷하게 구분이 되었다. 이는 정상 상피에서는 분열을 마친 후 분화하는 세포에서 발현이 증가되었다는 것을 알 수 있고, 중이 진주종 상피에서는 분열 중인 세포에서 발현이 감소했다는 것을 알 수 있다. 따라서 실제 임상에서 정상과 진주종과의 감별이 어려운 경우 유용하게 사용할 수 있는 표지자가 될 수 있을 것으로 생각된다. 또한 중이 진주종 상피의 변연형에 비해 분산형은 국소적으로 증식의 다양성을 나타내는 것으로 생각되며, 중이 진주종에서 좀 더 빠른 성장이나 골파괴 같은 공격적인 성향과 연관이 있을 것으로 보이기 때문에, 이에 대한 p27Kip1의 생성과 분해를 조절하는 기전에 대한 연구가 더욱 필요할 것으로 사료된다.

결     론

중이 진주종 상피에서 후이개 부위 정상 상피에 비해 p27Kip1의 발현이 감소되어 있는 것을 관찰할 수 있었다. 이는 세포주기 진행을 억제하는 p27Kip1의 감소로 세포주기 조절의 이상이 초래되어 세포의 과증식에 영향을 줄 수 있다는 것을 알았다. 따라서 p27Kip1을 이용한 면역조직화학적 염색이 중이 진주종 상피의 세포역학을 연구하는데 유용한 방법이라고 생각된다.


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